Her viser vi prosedyrene for FAM83A knockdown; analysene for å oppdage dens effekter på spredning, migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller; og sensibilisering av disse cellene til cisplatin. Denne studien gir et lovende målgen for livmorhalskreft og en referanse for videre legemiddelforskning.
Utforskningen av tumormålgener har avgjørende betydning for forebygging og behandling av livmorhalskreft. I denne studien skisserer vi trinnene som er involvert i identifiseringen av et tumormålgen FAM83A i livmorhalskreft. Først ble Cancer Genome Atlas-datasettet ansatt for å validere uttrykket og den prognostiske betydningen av FAM83A hos kvinner. Et lite forstyrrende RNA (siRNA) ble brukt til nedslag av FAM83A-genet i HeLa- og C33a-celler . Deretter ble 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) farging utført for å bestemme effektene på tumorcellens proliferasjonsevne. Sårheling og porøse membraninnsatsanalyser ble utført for å evaluere tumorcellemigrasjon og invasjonsevner.
Vestlig blotting ble brukt til å kvantifisere apoptoserelaterte proteinnivåer. JC-1-farging ble brukt til å evaluere mitokondrielle funksjonsendringer. Videre ble cisplatinintervensjon (diamindikloroplatinum, DDP) brukt for å vurdere det terapeutiske potensialet til målgenet. Flowcytometri og kolonidannelsesanalyser ble utført for å validere genets anticanceregenskaper ytterligere. Som et resultat ble FAM83A knockdown vist å hemme spredning, migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller og sensibilisere disse cellene til cisplatin. Disse omfattende metodene validerer samlet FAM83A som et tumorassosiert målgen, og holder løfte som et potensielt terapeutisk mål i forebygging og behandling av livmorhalskreft.
Livmorhalskreft er en global bekymring, da det er en av de ledende typene gynekologisk malignitet over hele verden og er den viktigste årsaken til kreftrelatert dødelighet hos kvinner1. Radikal kirurgi og kjemoradioterapi er forbundet med høye kurrater i primærstadiet. Imidlertid er behandlingsresultater for pasienter på avansert stadium av livmorhalskreft som utvikler metastatisk sykdom svært ugunstige2. Derfor er det avgjørende å forstå de biologiske mekanismene som ligger til grunn for migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller og identifisere potensielle terapeutiske mål for forebygging og behandling av denne sykdommen.
Identifisering av målgener involvert i kreftprogresjon og å finne måter å hemme deres uttrykk eller handling på, presenterer lovende behandlingsalternativer. I denne studien identifiserte vi FAM83 som et kreftfremkallende gen og undersøkte videre dets hemmende effekter på C33a– og HeLa-celler. FAM83 familie onkogener (FAM83A-H) er mye rapportert i humane kreftformer 3,4. Nylig ble FAM83A rapportert å være oppregulert i lunge5, bryst6, eggstokk7 og bukspyttkjertel8 kreftformer, noe som indikerer at FAM83A spiller en viktig rolle i kreftprogresjon ved å fremme spredning, invasjon, stamcellelignende egenskaper og stoffresistens i tumorcellene. Det er viktig at FAM83A ble identifisert som et av de nye kandidatgenene assosiert med cervikal lesjonsprogresjon og karsinogenese9. Til tross for bekreftelsen av forhøyet FAM83A-uttrykk i humane livmorhalskreftceller, forblir den spesifikke virkningen og underliggende mekanismer av FAM83A i livmorhalskreft uklar.
I denne studien skisserer vi protokollene som er involvert i identifiseringen av FAM83A som et tumormålgen i livmorhalskreft og bruker et lite forstyrrende RNA (siRNA) for knockdown av FAM83A-genet i HeLa- og C33a-celler . 5-Etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) farging ble utført for å bestemme effektene på tumorcelleproliferasjon, mens sårheling og porøse membraninnsatsanalyser bidro til å evaluere tumorcellemigrasjon og invasjonsevner.
Vestlig blotting ble utført for å bestemme nivåene av apoptoserelaterte proteiner, og JC-1-farging ble brukt til å evaluere mitokondrielle funksjonsendringer. Dermed rapporterte vi at FAM83A spiller en kritisk rolle i celleproliferasjon, metastase og invasjon i livmorhalskreft. Gjennom PI3K / AKT-pathway-assosiert mitokondriell dysfunksjon og apoptose, FAM83A knockdown sensibiliserte livmorhalskreftceller til cisplatin (diamindichloroplatinum, DDP). Denne studien gir et nytt mål for livmorhalskreft og muligens andre kreftformer og en referanse for utvikling av strategier for å overvinne motstanden av kreftceller til visse kjemoterapeutiske legemidler.
Undersøkelsen av tumormålgener er av største betydning for både forebygging og behandling av livmorhalskreft. Å forstå de spesifikke genene som spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av livmorhalskreft gir verdifull innsikt i de underliggende molekylære mekanismene til sykdommen. Videre kan identifisering av disse målgenene føre til utvikling av nye terapeutiske strategier og målrettede terapier. I denne studien beskriver vi bruken av TCGA-datasettanalyse for å identifisere FAM83A som et m?…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (nr. 2020HC06).
Cells and Medium Formulation | |||
C33a | American Type Culture Collection | ||
Hela | American Type Culture Collection | ||
Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
Antibody Information | |||
AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
Materials | |||
6-well plate | Corning, NPY | ||
Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
Software | |||
Image-Pro | plus 6.0 |