Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.
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Artigo de método
Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Espera-se que as células-tronco pluripotentes induzidas pelo ser humano (hiPSCs) com infinita capacidade de autoproliferação tenham aplicações em vários campos, incluindo a elucidação de patologias de doenças raras, o desenvolvimento de novos medicamentos e a medicina regenerativa com o objetivo de restaurar órgãos danificados. Apesar disso, a implementação social de hiPSCs ainda é limitada. Isso se deve, em parte, à dificuldade de reproduzir a diferenciação na cultura, mesmo com conhecimentos avançados e habilidades técnicas sofisticadas, devido à alta sensibilidade das iPSCs a mudanças ambientais diminutas. A aplicação de um sistema de cultura automatizado pode resolver essa questão. Experimentos com alta reprodutibilidade, independentemente da habilidade do pesquisador, podem ser esperados de acordo com um procedimento compartilhado entre vários institutos. Embora vários sistemas de cultura automatizados que podem manter culturas iPSC e induzir diferenciação tenham sido desenvolvidos anteriormente, esses sistemas são pesados, grandes e caros, pois fazem uso de braços robóticos humanizados e multiarticulados. Para melhorar as questões acima, desenvolvemos um novo sistema usando um sistema simples de trilho deslizante de eixo x-y-z, permitindo que ele seja mais compacto, leve e barato. Além disso, o usuário pode facilmente modificar parâmetros no novo sistema para desenvolver novas tarefas de manuseio. Uma vez que uma tarefa é estabelecida, tudo o que o usuário precisa fazer é preparar o iPSC, fornecer os reagentes e consumíveis necessários para a tarefa desejada com antecedência, selecionar o número da tarefa e especificar o tempo. Confirmamos que o sistema poderia manter as iPSCs em um estado indiferenciado através de várias passagens sem células alimentadoras e diferenciar-se em vários tipos celulares, incluindo cardiomiócitos, hepatócitos, progenitores neurais e queratinócitos. O sistema permitirá experimentos altamente reprodutíveis em todas as instituições sem a necessidade de pesquisadores qualificados e facilitará a implementação social de hiPSCs em uma gama mais ampla de campos de pesquisa, diminuindo os obstáculos para novas entradas.
Introdução
Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos reais e detalhados de manejo para um sistema automatizado de cultura de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC), que produzimos em colaboração com uma empresa, e mostrar resultados representativos.
Desde a publicação do artigo em 2007, o iPSC vem chamando a atenção em todo o mundo1. Devido à sua maior característica de poder diferenciar-se em qualquer tipo de célula somática, espera-se que seja aplicado em vários campos, como a medicina regenerativa, a elucidação das causas de doenças intratáveis e o desenvolvimento de novos fármacos....
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Protocolo
O Comitê de Ética da Universidade de Medicina de Kansai aprovou a geração e o uso das iPSCs derivadas de voluntários saudáveis chamadas KMUR001 (aprovação nº 2020197). O doador, que foi recrutado abertamente, forneceu consentimento informado formal e concordou com o uso científico das células.
NOTA: A interface atual (o software especial chamado "ccssHMI" em execução no sistema operacional Windows XP) é a tela de operação fundamental. Sob a interface acima mencionada, uma série de abas são organizadas, permitindo que os usuários iniciem várias operações.
1. Operações de carregamento
- Cli....
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Resultados
Manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem
Foram utilizadas três linhagens de hPSC (RIKEN-2F, 253G1 e KMUR001). Otimizamos o protocolo de manutenção através de experimentos manuais diários e otimizamos ainda mais os programas detalhados através dos sete experimentos preliminares realizados pelo sistema. Por exemplo, as tensões de cisalhamento causadas pelas velocidades do líquido do fluxo do espeto de diferentes pipets manuseadas por humanos e pelo sistema são bastante diferentes;.......
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Discussão
Uma etapa crítica no protocolo é que, se um usuário encontrar alguma falha, clique no botão cancelar, parar ou redefinir a qualquer momento e recomeçar a partir da primeira etapa. O software pode evitar erros humanos, incluindo reserva dupla, abertura de portas enquanto as tarefas do sistema estão ativas e falta de reabastecimento. Outro ponto crítico para o sucesso e a diferenciação eficiente da célula somática desejada é a seleção adequada de linhagens de células-tronco pluripotentes, pois cada célula-tronco pluripoten.......
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Divulgações
O autor não tem nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por uma bolsa do New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japão.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,15% fração de albumina de soro bovino V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japão | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| placas de plástico de 10 cm | Corning Inc., NY, Estados Unidos | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinina camundongo | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumina coelho | Dako | A0001 | |
| Ácido retinóico totalmente trans | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Sistema de cultura automatizado | Suplemento Panasonic | ||
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Soro bovino albumina | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, Estados Unidos #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Queratinócitos Definidos-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Meio de queratinócitos humanos |
| Dexametasona | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontário, Canadá | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecilglicerol |
| Hemocitômetro descartável | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorfina | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco' s Eagle modificado médio/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | ||
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essencial 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Meio de células-tronco pluripotentes humanas |
| Soro fetal bovino | Biowest, FL, Estados Unidos | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292. | |
| Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Suplemento de Glutamina |
| IgG de Cabra(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A cabra | Santacruz | 6556 | |
| Hidrocortisona | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hidrocortisona 21-hemisuccinato | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Seda | Nippi Inc., Tóquio, Japão | 892 021 | Matriz de cultura celular |
| Insulina-transferrina-selênio | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Queratina 1 camundongo | Santacruz | 376224 | |
| Queratina 10 coelho | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | iPSCs derivadas de pacientes | |
| Substituição de soro knockout | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| ácido L-ascórbico 2-fosfato | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz' s L-15 médio | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | ||
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| Suplemento N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Meio neurobasal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilamento coelho | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Gö ttingen, Alemanha | 05-100-1A | meio de cultura de células |
| 3/4 de outubro camundongo | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japão | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Albumina humana recombinante | A0237, Merck, Darmstadt, Alemanha | A9731 | |
| Inibidor de Rho quinase, Y-27632 | Sellec Inc., Tóquio, Japão | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | hiPSCs indiferenciados |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| L-ascorbato de Sódio | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tóquio, Japão | AK02 | meio de cultura de células |
| TnT coelho | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 camundongo | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodotironina | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos | 12604013 | |
| Solução azul de tripano | Nacalai Tesque, Kyoto, Japão | 20577-34 | |
| Caldo de fosfato de triptose | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, Reino Unido | 5148 | |
β  Tublin mouse | Promega | G712A |
Referências
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induce....
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Reimpressões e permissões
