High-throughput optogenetica-experimenten in gist met behulp van het geautomatiseerde platform Lustro
Summary
Dit protocol schetst de stappen voor het gebruik van het geautomatiseerde platform Lustro om high-throughput karakterisering van optogenetische systemen in gist uit te voeren.
Abstract
Optogenetica biedt nauwkeurige controle over cellulair gedrag door gebruik te maken van genetisch gecodeerde lichtgevoelige eiwitten. Het optimaliseren van deze systemen om de gewenste functionaliteit te bereiken, vereist echter vaak meerdere ontwerp-bouw-testcycli, die tijdrovend en arbeidsintensief kunnen zijn. Om deze uitdaging aan te gaan, hebben we Lustro ontwikkeld, een platform dat lichtstimulatie combineert met laboratoriumautomatisering, waardoor efficiënte high-throughput screening en karakterisering van optogenetische systemen mogelijk wordt.
Lustro maakt gebruik van een automatiseringswerkplek die is uitgerust met een verlichtingsapparaat, een schudapparaat en een plaatlezer. Door gebruik te maken van een robotarm automatiseert Lustro de beweging van een microtiterplaat tussen deze apparaten, waardoor optogenetische stammen kunnen worden gestimuleerd en hun respons kan worden gemeten. Dit protocol biedt een stap-voor-stap handleiding voor het gebruik van Lustro om optogenetische systemen te karakteriseren voor de controle van genexpressie in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Het protocol omvat de installatie van de componenten van Lustro, inclusief de integratie van het verlichtingsapparaat met het automatiseringswerkstation. Het biedt ook gedetailleerde instructies voor het programmeren van het verlichtingsapparaat, de plaatlezer en de robot, waardoor een soepele werking en gegevensverzameling tijdens het experimentele proces wordt gegarandeerd.
Introduction
Optogenetica is een krachtige techniek die gebruik maakt van lichtgevoelige eiwitten om het gedrag van cellen met hoge precisie te controleren 1,2,3. Het maken van prototypes van optogenetische constructies en het identificeren van optimale verlichtingsomstandigheden kan echter tijdrovend zijn, waardoor het moeilijk is om optogenetische systemen te optimaliseren 4,5. High-throughput-methoden om de activiteit van optogenetische systemen snel te screenen en te karakteriseren, kunnen de ontwerp-bouw-testcyclus versnellen voor het maken van prototypes van constructen en het onderzoeken van hun functie.
Het Lustrom-platform is ontwikkeld als een laboratoriumautomatiseringstechniek die is ontworpen voor high-throughput screening en karakterisering van optogenetische systemen. Het integreert een microplaatlezer, verlichtingsapparaat en schudapparaat met een automatiseringswerkstation6. Lustro combineert geautomatiseerde kweek en lichtstimulatie van cellen in microtiterplaten (Figuur 1 en aanvullende Figuur 1), waardoor een snelle screening en vergelijking van verschillende optogenetische systemen mogelijk is. Het Lustro-platform is zeer aanpasbaar en kan worden gegeneraliseerd om te werken met andere laboratoriumautomatiseringsrobots, verlichtingsapparaten, plaatlezers, celtypen en optogenetische systemen, inclusief systemen die reageren op verschillende golflengten van licht.
Dit protocol demonstreert de opzet en het gebruik van Lustro voor het karakteriseren van een optogenetisch systeem. Optogenetische controle van gesplitste transcriptiefactoren in gist wordt gebruikt als een voorbeeldsysteem om de functie en het nut van het platform te illustreren door de relatie tussen lichtinput en de expressie van een fluorescerend reportergen, mScarlet-I7, te onderzoeken. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers de optimalisatie van optogenetische systemen stroomlijnen en de ontdekking van nieuwe strategieën voor de dynamische controle van biologische systemen versnellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde Ludro-protocol automatiseert de kweek-, belichtings- en meetprocessen, waardoor high-throughput screening en karakterisering van optogenetische systemen mogelijk wordt6. Dit wordt bereikt door een verlichtingsapparaat, een microplaatlezer en een schudapparaat te integreren in een automatiseringswerkstation. Dit protocol demonstreert specifiek het nut van Lustro voor het screenen van verschillende optogenetische constructen die zijn geïntegreerd in de gist S. cerevisiae…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie R35GM128873 en de National Science Foundation-subsidie 2045493 (toegekend aan M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. heeft een Career Award bij de Scientific Interface van het Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. werd ondersteund door een NHGRI-trainingssubsidie voor het Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. We erkennen vruchtbare discussies met McClean-lableden, en in het bijzonder zijn we Kieran Sweeney dankbaar voor het leveren van commentaar op het manuscript.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
Referências
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengenharia. 7 (4), 151 (2020).
