Denne protokollen skisserer trinnene for bruk av den automatiserte plattformen Lustro for å utføre høy gjennomstrømningskarakterisering av optogenetiske systemer i gjær.
Optogenetikk gir presis kontroll over cellulær oppførsel ved å benytte genetisk kodede lysfølsomme proteiner. Optimalisering av disse systemene for å oppnå ønsket funksjonalitet krever imidlertid ofte flere design-build-test-sykluser, noe som kan være tidkrevende og arbeidskrevende. For å møte denne utfordringen har vi utviklet Lustro, en plattform som kombinerer lysstimulering med laboratorieautomatisering, noe som muliggjør effektiv screening og karakterisering av optogenetiske systemer med høy gjennomstrømning.
Lustro benytter en automatiseringsarbeidsstasjon utstyrt med en belysningsenhet, en risteanordning og en plateleser. Ved å bruke en robotarm automatiserer Lustro bevegelsen av en mikrobrønnplate mellom disse enhetene, noe som muliggjør stimulering av optogenetiske stammer og måling av deres respons. Denne protokollen gir en trinnvis veiledning om bruk av Lustro for å karakterisere optogenetiske systemer for genuttrykkskontroll i den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae. Protokollen dekker oppsettet av Lustros komponenter, inkludert integrering av belysningsenheten med automatiseringsarbeidsstasjonen. Den gir også detaljerte instruksjoner for programmering av belysningsenheten, plateleseren og roboten, noe som sikrer jevn drift og datainnsamling gjennom hele eksperimentprosessen.
Optogenetikk er en kraftig teknikk som benytter lysfølsomme proteiner for å kontrollere oppførselen til celler med høy presisjon 1,2,3. Imidlertid kan prototyping av optogenetiske konstruksjoner og identifisering av optimale belysningsforhold være tidkrevende, noe som gjør det vanskelig å optimalisere optogenetiske systemer 4,5. Høykapasitetsmetoder for raskt å skjerme og karakterisere aktiviteten til optogenetiske systemer kan akselerere design-build-test-syklusen for prototyping av konstruksjoner og utforsking av deres funksjon.
Lustro-plattformen ble utviklet som en laboratorieautomatiseringsteknikk designet for høy gjennomstrømningsscreening og karakterisering av optogenetiske systemer. Den integrerer en mikroplateleser, belysningsenhet og risteenhet med en automatiseringsarbeidsstasjon6. Lustro kombinerer automatisert dyrking og lysstimulering av celler i mikrobrønnplater (figur 1 og tilleggsfigur 1), noe som muliggjør rask screening og sammenligning av forskjellige optogenetiske systemer. Lustro-plattformen er svært tilpasningsdyktig og kan generaliseres til å fungere med andre laboratorieautomatiseringsroboter, belysningsenheter, platelesere, celletyper og optogenetiske systemer, inkludert de som reagerer på forskjellige bølgelengder av lys.
Denne protokollen demonstrerer oppsettet og bruken av Lustro for å karakterisere et optogenetisk system. Optogenetisk kontroll av delte transkripsjonsfaktorer i gjær brukes som et eksempelsystem for å illustrere funksjonen og nytten av plattformen ved å undersøke forholdet mellom lysinnganger og uttrykket av et fluorescerende reportergen, mScarlet-I7. Ved å følge denne protokollen kan forskere strømlinjeforme optimaliseringen av optogenetiske systemer og akselerere oppdagelsen av nye strategier for dynamisk kontroll av biologiske systemer.
Lustro-protokollen som presenteres her automatiserer dyrkings-, belysnings- og måleprosessene, noe som muliggjør høy gjennomstrømningsscreening og karakterisering av optogenetiske systemer6. Dette oppnås ved å integrere en belysningsenhet, mikroplateleser og risteenhet i en automatiseringsarbeidsstasjon. Denne protokollen demonstrerer spesifikt Lustros nytte for screening av forskjellige optogenetiske konstruksjoner integrert i gjæren S. cerevisiae og sammenligning av lysinduksjons…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant R35GM128873 og National Science Foundation grant 2045493 (tildelt MNM). Megan Nicole McClean, Ph.D. har en Career Award på Scientific Interface fra Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. ble støttet av et NHGRI treningsstipend til Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. Vi anerkjenner fruktbare diskusjoner med McClean lab-medlemmer, og spesielt er vi takknemlige for Kieran Sweeney for å gi kommentarer til manuskriptet.
96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
Spark (plate reader) | Tecan | ||
Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |