Experimentos de optogenética de alto rendimiento en levaduras utilizando la plataforma automatizada Lustro
Summary
Este protocolo describe los pasos para utilizar la plataforma automatizada Lustro para realizar una caracterización de alto rendimiento de los sistemas optogenéticos en levaduras.
Abstract
La optogenética ofrece un control preciso sobre el comportamiento celular mediante la utilización de proteínas sensibles a la luz codificadas genéticamente. Sin embargo, la optimización de estos sistemas para lograr la funcionalidad deseada a menudo requiere múltiples ciclos de diseño, construcción y prueba, que pueden llevar mucho tiempo y mano de obra. Para hacer frente a este reto, hemos desarrollado Lustro, una plataforma que combina la estimulación lumínica con la automatización del laboratorio, lo que permite un cribado y caracterización eficientes de alto rendimiento de los sistemas optogenéticos.
Lustro utiliza una estación de trabajo de automatización equipada con un dispositivo de iluminación, un dispositivo de agitación y un lector de placas. Mediante el empleo de un brazo robótico, Lustro automatiza el movimiento de una placa de micropocillos entre estos dispositivos, lo que permite la estimulación de cepas optogenéticas y la medición de su respuesta. Este protocolo proporciona una guía paso a paso sobre el uso de Lustro para caracterizar los sistemas optogenéticos para el control de la expresión génica en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. El protocolo cubre la configuración de los componentes de Lustro, incluida la integración del dispositivo de iluminación con la estación de trabajo de automatización. También proporciona instrucciones detalladas para programar el dispositivo de iluminación, el lector de placas y el robot, lo que garantiza un funcionamiento fluido y la adquisición de datos durante todo el proceso experimental.
Introduction
La optogenética es una técnica poderosa que utiliza proteínas sensibles a la luz para controlar el comportamiento de las células con alta precisión 1,2,3. Sin embargo, la creación de prototipos de construcciones optogenéticas y la identificación de las condiciones óptimas de iluminación pueden llevar mucho tiempo, lo que dificulta la optimización de los sistemas optogenéticos 4,5. Los métodos de alto rendimiento para detectar y caracterizar rápidamente la actividad de los sistemas optogenéticos pueden acelerar el ciclo de diseño, construcción y prueba para la creación de prototipos de construcciones y la exploración de su función.
La plataforma Lustro fue desarrollada como una técnica de automatización de laboratorio diseñada para el cribado y caracterización de sistemas optogenéticos de alto rendimiento. Integra un lector de microplacas, un dispositivo de iluminación y un dispositivo de agitación con una estación de trabajo de automatización6. Lustro combina el cultivo automatizado y la estimulación lumínica de células en placas de micropocillos (Figura 1 y Figura 1 suplementaria), lo que permite el cribado y la comparación rápidos de diferentes sistemas optogenéticos. La plataforma Lustro es altamente adaptable y se puede generalizar para trabajar con otros robots de automatización de laboratorio, dispositivos de iluminación, lectores de placas, tipos de células y sistemas optogenéticos, incluidos aquellos que responden a diferentes longitudes de onda de luz.
Este protocolo demuestra la configuración y el uso de Lustro para caracterizar un sistema optogenético. El control optogenético de los factores de transcripción divididos en levaduras se utiliza como sistema de ejemplo para ilustrar la función y utilidad de la plataforma mediante el sondeo de la relación entre las entradas de luz y la expresión de un gen indicador fluorescente, mScarlet-I7. Siguiendo este protocolo, los investigadores pueden agilizar la optimización de los sistemas optogenéticos y acelerar el descubrimiento de nuevas estrategias para el control dinámico de los sistemas biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo Lustro presentado aquí automatiza los procesos de cultivo, iluminación y medición, lo que permite el cribado y la caracterización de sistemas optogenéticos de alto rendimiento6. Esto se logra mediante la integración de un dispositivo de iluminación, un lector de microplacas y un dispositivo de agitación en una estación de trabajo de automatización. Este protocolo demuestra específicamente la utilidad de Lustro para el cribado de diferentes constructos optogenéticos integra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la R35GM128873 de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y la 2045493 de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias (otorgadas al M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. tiene un Premio a la Carrera en la Interfaz Científica del Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. recibió el apoyo de una beca de capacitación del NHGRI para el Programa de Capacitación en Ciencias Genómicas 5T32HG002760. Reconocemos las fructíferas discusiones con los miembros del laboratorio McClean y, en particular, agradecemos a Kieran Sweeney por proporcionar comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
Referências
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengenharia. 7 (4), 151 (2020).
