Hochdurchsatz-Optogenetik-Experimente in Hefe mit der automatisierten Plattform Lustro
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Verwendung der automatisierten Plattform Lustro zur Durchführung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung optogenetischer Systeme in Hefe.
Abstract
Die Optogenetik bietet eine präzise Kontrolle des zellulären Verhaltens durch die Verwendung genetisch kodierter lichtempfindlicher Proteine. Die Optimierung dieser Systeme, um die gewünschte Funktionalität zu erreichen, erfordert jedoch oft mehrere Design-Build-Test-Zyklen, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein können. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir Lustro entwickelt, eine Plattform, die Lichtstimulation mit Laborautomatisierung kombiniert und so ein effizientes Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme ermöglicht.
Lustro verfügt über einen Automationsarbeitsplatz, der mit einer Beleuchtungsvorrichtung, einer Schüttelvorrichtung und einem Plattenleser ausgestattet ist. Durch den Einsatz eines Roboterarms automatisiert Lustro die Bewegung einer Mikrotiterplatte zwischen diesen Geräten und ermöglicht so die Stimulation optogenetischer Stämme und die Messung ihrer Reaktion. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung von Lustro zur Charakterisierung optogenetischer Systeme zur Genexpressionskontrolle in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das Protokoll umfasst die Einrichtung der Lustro-Komponenten, einschließlich der Integration des Beleuchtungsgeräts in die Automatisierungsstation. Es enthält auch detaillierte Anweisungen für die Programmierung des Beleuchtungsgeräts, des Plattenlesers und des Roboters, um einen reibungslosen Betrieb und eine reibungslose Datenerfassung während des gesamten Versuchsprozesses zu gewährleisten.
Introduction
Die Optogenetik ist eine leistungsfähige Technik, die lichtempfindliche Proteine nutzt, um das Verhalten von Zellen mit hoher Präzision zu steuern 1,2,3. Das Prototyping optogenetischer Konstrukte und die Identifizierung optimaler Beleuchtungsbedingungen können jedoch zeitaufwändig sein, was die Optimierung optogenetischer Systeme erschwert 4,5. Hochdurchsatzmethoden zum schnellen Screening und zur Charakterisierung der Aktivität optogenetischer Systeme können den Design-Build-Test-Zyklus für das Prototyping von Konstrukten und die Erforschung ihrer Funktion beschleunigen.
Die Lustro-Plattform wurde als Laborautomatisierungstechnik für das Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme entwickelt. Es integriert einen Mikroplatten-Reader, eine Beleuchtungsvorrichtung und eine Schüttelvorrichtung mit einer Automatisierungs-Workstation6. Lustro kombiniert die automatisierte Kultivierung und Lichtstimulation von Zellen in Mikrotiterplatten (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 1) und ermöglicht so das schnelle Screening und den Vergleich verschiedener optogenetischer Systeme. Die Lustro-Plattform ist hochgradig anpassungsfähig und kann verallgemeinert werden, um mit anderen Laborautomatisierungsrobotern, Beleuchtungsgeräten, Plattenlesegeräten, Zelltypen und optogenetischen Systemen zu arbeiten, einschließlich solcher, die auf verschiedene Wellenlängen des Lichts reagieren.
Dieses Protokoll demonstriert den Aufbau und die Verwendung von Lustro zur Charakterisierung eines optogenetischen Systems. Die optogenetische Kontrolle von gespaltenen Transkriptionsfaktoren in Hefe wird als Beispielsystem verwendet, um die Funktion und den Nutzen der Plattform zu veranschaulichen, indem die Beziehung zwischen Lichteinträgen und der Expression eines fluoreszierenden Reportergens, mScarlet-I7, untersucht wird. Durch die Befolgung dieses Protokolls können Forscher die Optimierung optogenetischer Systeme rationalisieren und die Entdeckung neuer Strategien für die dynamische Steuerung biologischer Systeme beschleunigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Lustro-Protokoll automatisiert die Kultivierungs-, Beleuchtungs- und Messprozesse und ermöglicht so das Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme6. Dies wird durch die Integration eines Beleuchtungsgeräts, eines Mikroplatten-Readers und eines Schüttelgeräts in einen Automatisierungsarbeitsplatz erreicht. Dieses Protokoll demonstriert insbesondere die Nützlichkeit von Lustro für das Screening verschiedener optogenetischer Konstrukte, die i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das National Institutes of Health Grant R35GM128873 und das National Science Foundation Grant 2045493 (vergeben an M.N.M.) unterstützt. Megan Nicole McClean, Ph.D., ist Trägerin des Career Award am Scientific Interface des Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. wurde durch ein NHGRI-Schulungsstipendium für das Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760 unterstützt. Wir danken den fruchtbaren Gesprächen mit den Mitgliedern des McClean-Labors und insbesondere Kieran Sweeney für die Bereitstellung von Kommentaren zum Manuskript.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
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