Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Resumo

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.

Resumo

As células ciliadas da cóclea são os receptores sensoriais do sistema auditivo. Essas células estão localizadas no órgão de Corti, órgão sensorial responsável pela audição, dentro do labirinto ósseo da orelha interna. As células ciliadas da cóclea consistem em dois tipos anatomicamente e funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. Danos a qualquer um deles resultam em perda auditiva. Notavelmente, como as células ciliadas internas não podem se regenerar, e os danos a elas são permanentes. Assim, o cultivo in vitro de células ciliadas primárias é indispensável para investigar os efeitos protetores ou regenerativos das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos.

Após a remoção manual da parede lateral da cóclea, o epitélio auditivo foi meticulosamente dissecado do modíolo coclear ao microscópio, incubado em uma mistura composta de tripsina-EDTA a 0,25% por 10 min a 37 °C e suavemente suspenso em meio de cultura com ponta de pipeta de 200 μL. A suspensão celular foi passada através de um filtro de células, o filtrado foi centrifugado e as células foram cultivadas em placas de 24 poços. As células ciliadas foram identificadas com base em sua capacidade de expressar um complexo mecanotransdutor, a miosina-VIIa, que está envolvido em tensões motoras, e via marcação seletiva de F-actina usando faloidina. As células atingiram >90% de confluência após 4 dias em cultura. Este método pode melhorar nossa compreensão das características biológicas de células ciliadas cultivadas in vitro e demonstrar a eficiência das culturas de células ciliadas cocleares, estabelecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas auditivas.

Introdução

As células ciliadas da cóclea desempenham papéis importantes na detecção do som e na transmissão do sinal para o nervo auditivo. As células ciliadas são células mecanicistas que funcionam como receptores sensoriais primários e convertem vibrações sonoras em sinais elétricos em vertebrados. O epitélio sensorial da orelha interna de mamíferos é composto por uma única fileira de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas. Em diferentes áreas da membrana básica, as células ciliadas percebem sons em diferentes frequências (entre 20 e 2.000 Hz)¹. A função das células ciliadas externas é um processo de amplificação mecânica....

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados (nº 2021-847) pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Xi'an Jiaotong.

1. Esterilização e preparo do material

1. Esterilizar as ferramentas de dissecção usando desinfecção a vapor de alta temperatura e alta pressão e secá-las em uma incubadora de 50 °C durante a noite.
2. Preparar 100 mL do meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e 10 mg/mL de penicilina/estreptomicina (adicionar 10 mL de SFB e 10 μL de solução estoque de penicilina a 90 mL de meio de águia modificado (EMEM) de Dulbecco e armazenar a 4 °C.

Resultados

Seguindo este protocolo, as células isoladas foram semeadas. Sementes de células ciliadas primárias da cóclea foram consideradas bem-sucedidas se as células não flutuassem no meio de cultura e se espalhassem em 24 h. Determinamos o número de células ciliadas após aderirem e se espalharem em agregados planos no fundo da placa. Após 1 dia, as células ciliadas vivas foram firmemente aderidas ao fundo da placa de cultura e as células não aderentes foram removidas por enxágüe com PBS. Tipicamente, o número de células dobrou a.......

Discussão

Em comparação com a linhagem celular HEI-OC1, culturas primárias de células ciliadas replicaram com mais precisão o estado fisiológico das células in vivo. Portanto, o método de cultura primária auditiva estabelecido pelo isolamento de células vivas dos órgãos cocleares e sua cultura imediata parece ser uma ferramenta valiosa para uma extensa pesquisa sobre sistemas auditivos. Certas técnicas são cruciais para uma cultura de sucesso. Primeiro, minimizar a duração da separação do órgão de Corti do osso temporal aumenta a .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de células BioLite de 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	usando para cultura
Placa de cultura de células Nunc de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150318	usando para cultura
palato de 6 poços	Thermo Fisher Scientific	310109005	usando para cultura
70 µ filtros de células m	BD Company	352350	usando para filtro
Alexa Fluor 488 Faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379	coloração imunofluorescente
Anti-coelho IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	coloração imunofluorescente
dia 3-5 neonatal murino			fornecido pela Universidade Xi'an Jiaotong
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	usando para cultura
Soro Fetal Bovino	Thermo Fisher Scientific	12483020	usando para cultura
Fórceps	Dumont	5 #	usando para dissecção
Leica microscópio de anatomia	Alemanha	S9i	usando para dissecção
Penicilina / estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122	usando para cultura
Coelho plyclonal para Miosina VIIa	Abcam empresa	ab92996	coloração imunofluorescente
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	usando para dissecção
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	imunofluorescência que
colore a tripsina	Thermo Fisher 25200072		científica usando-se para a cultura