Aqui, apresentamos o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por Agrobacterium tumefaciens para produzir plantas compostas.
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Artigo de método
Um Método Eficiente e Reprodutível para Produção de Compósitos por Transformação de Raízes Pelosas à Base de Agrobacterium rhizogenes
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A produção de plantas compostas com raízes transgênicas e caules e gemas não transgênicas usando a transformação de raízes pilosas mediada por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta poderosa para estudar a biologia relacionada às raízes. A transformação de raízes pilosas é estabelecida em uma ampla gama de dicotiledôneas e em várias espécies de monocotiledôneas e é quase independente do genótipo. O método tradicional de injeção de hipocótilo com A. rhizogenes para obtenção de plantas compostas é ineficiente, demorado, trabalhoso e frequentemente causa a morte de plantas tenras e minúsculas de hipocótilo. Uma transformação radicular pilosa altamente eficiente, de uma etapa, mediada por A. rhizogenes , foi estabelecida previamente, o que elimina a necessidade de transplante após a produção de raízes pilosas. Neste estudo, um hipocótilo parcial e uma raiz primária foram removidos, o local da incisão do hipocótilo foi recoberto com A. rhizogenes e, em seguida, os hipocótilos foram plantados em vermiculita estéril. Após 12 dias de cultivo, a incisão do hipocótilo expandiu-se e novas raízes pilosas foram induzidas. Este artigo fornece o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por A. rhizogenes, com sua eficácia demonstrada pela produção de plantas compostas de soja silvestre, Solanum americanum e abóbora.
Introdução
Agrobacterium rhizogenes é uma bactéria gram-negativa do solo da família Rhizobiaceae. A. rhizogenes pode infectar quase todas as dicotiledôneas, algumas monocotiledôneas e gimnospermas individuais através de feridas, produzindo raízes pilosas em plantas infectadas. A bactéria carrega o plasmídeo Ri (indutor de raízes), e o T-DNA do plasmídeo Ri carrega o gene de síntese de opina e os genes rol (genes do locus radicular). Após o DNA-T do plasmídeo Ri entrar em uma célula vegetal e se integrar a um cromossomo hospedeiro, a expressão dos genes rol induz a produção de raízes pilosas1. Um vetor de expre....
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Protocolo
1. Condições de crescimento vegetal e cultivo de A. rhizogenes
- Semeadura de sementes
NOTA: Sementes silvestres de soja foram coletadas no condado de Yanggu, Liaocheng, China; sementes de S. americanum e abóbora variedade local Yinsu foram compradas em um mercado.- Coletar sementes de soja selvagem, S. americanum, e a variedade local de abóbora, semeá-las em vermiculita a uma profundidade de 1 cm e regá-las completamente. Plante 20 sementes em caixas plásticas de 8 cm x 11 cm x 9 cm. Cultivar as plantas em câmara de crescimento a 24 ± 2 °C com ciclo claro/8 h escuro de 16 h a aproximadamente 70% de umidade....
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Resultados
Transformação de raiz pilosa mediada por A. rhizogenes em uma etapa altamente eficiente
Raízes pilosas foram produzidas no local da incisão do hipocótilo 12 dias após a inoculação com K599 modificado. As raízes pilosas transgênicas foram determinadas com base na expressão do gene repórter contido no vetor binário. Raízes transgênicas transformadas com o gene repórter DsRed2 de soja silvestre composta, S. americanum e abóbora foram observadas sob luz de excitação natural (Fig.......
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Discussão
O método de raiz pilosa mediada por A. rhizogenes em uma etapa é um método mais simples e eficiente para a produção de plantas compostas do que o método de injeção de hipocótilo. O método ARM de uma etapa melhora significativamente a eficiência da transformação de raízes pilosas, encurta o tempo para produzir raízes pilosas, aumenta o número de raízes pilosas e reduz a quantidade de trabalho envolvido. O protocolo de transformação aprimorado é ideal para estudos de simbioses entre leguminosas e rizóbios e entre .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa da Universidade de Liaocheng (318012028) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (ZR2020MC034).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| caixa de plástico | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| abóbora | variedade local Yinsu | ||
| estreptomicina | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi máquina | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | sistema de imagem de quimioluminescência |
| tomate | variedade local Zhongshu4 | ||
| selvagem | coletada no condado de Yanggu, Liaocheng, China |
Referências
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al.
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Reimpressões e permissões
