Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR)-basert rask diagnose av Helicobacter pylori-infeksjon og antibiotikaresistens

Summary

Protokollen presenterer en ikke-invasiv metode for rask diagnose av Helicobacter pylori mageinfeksjoner gjennom strengtesten og bestemmer dens antibiotikaresistens mot klaritromycin og levofloksacin ved bruk av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR).

Abstract

Helicobacter pylori er et stort menneskelig patogen som infiserer omtrent halvparten av den globale befolkningen og blir en alvorlig helsetrussel på grunn av sin økende antibiotikaresistens. Det er årsaken til kronisk aktiv gastritt, magesårssykdom og magekreft og har blitt klassifisert som et gruppe I kreftfremkallende middel av International Agency for Research on Cancer. Derfor er den raske og nøyaktige diagnosen H. pylori og bestemmelsen av dens antibiotikaresistens viktig for effektiv utryddelse av dette bakterielle patogenet. For tiden inkluderer H. pylori-diagnosemetoder hovedsakelig urea-pustetesten (UBT), antigentesten, serumantistofftesten, gastroskopi, rask ureasetest (RUT) og bakteriekultur. Blant dem er de tre første deteksjonsmetodene ikke-invasive, noe som betyr at de er enkle tester å utføre. Bakterier kan imidlertid ikke hentes gjennom disse teknikkene; Dermed kan ikke resistenstesting utføres. De tre siste er invasive undersøkelser, men de er kostbare, krever høy kompetanse og har potensial til å skade pasienter. Derfor er en ikke-invasiv, rask og samtidig metode for H. pylori-deteksjon og resistenstesting svært viktig for effektivt å utrydde H. pylori i klinisk praksis. Denne protokollen tar sikte på å presentere en spesifikk prosedyre som involverer strengtesten i kombinasjon med kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) for rask påvisning av H. pylori-infeksjon og antibiotikaresistens. I motsetning til bakteriekulturer, tillater denne metoden enkel, rask, ikke-invasiv diagnose av H. pylori-infeksjonsstatus og stoffresistens. Spesielt brukte vi qPCR for å oppdage rea for H. pylori-infeksjon og mutasjoner i 23S rRNA- og gyrA-gener, som koder for motstand mot henholdsvis klaritromycin og levofloksacin. Sammenlignet med rutinemessig brukte dyrkingsteknikker, gir denne protokollen en ikke-invasiv, billig og tidsbesparende teknikk for å oppdage H. pylori-infeksjon og bestemme dens antibiotikaresistens ved hjelp av qPCR.

Introduction

H. pylori er en spiralformet, svært bevegelig, gramnegativ bakterie som hovedsakelig lever i pylorusområdet i magen¹. Det er et vanlig patogen som infiserer nesten 50% av den globale befolkningen². De fleste med H. pylori-infeksjon har ingen kliniske manifestasjoner, og de fleste utvikler forskjellige sykdommer etter flere års infeksjon, inkludert kronisk gastritt, magesår, magesår og magekreft³. I flere studier basert på forskjellige populasjoner har effekten av å eliminere H. pylori for å forebygge magekreft og forstadier til kreft blitt vist ^4,5. Derfor har Verdens helseorganisasjon (WHO) International Agency for Research on Cancer anbefalt H. pylori-utryddelse som et forebyggende tiltak⁶.

Bruk av ikke-invasive metoder for å identifisere H. pylori-infeksjon er en nøkkelkomponent i behandlingen for de fleste personer med asymptomatisk dyspepsi. Urea pustetest (UBT), H. pylori fekal antigen test (SAT), og serologisk testing er populære ikke-invasive teknikker. Blant disse er UBT den minst påtrengende og mest nøyaktige prosedyren som er tilgjengelig. UBT bruker urease, rikelig tilstede i H. pylori, for å hydrolysere isotopisk merket urea til ammoniakk og karbondioksid (13C eller 14C). I motsetning til dette er immunokromatografisk analyse (ICA) ⁷ praktisk, enkel og ikke-invasiv for prøvetaking. Nøyaktigheten av testen påvirkes imidlertid av flere faktorer, for eksempel kvaliteten på avføringsprøven, temperaturen og intervallet mellom prøveinnsamlingen og testingen. En annen test basert på immunresponsen er serum H. pylori-antistofftesten , som oppdager antistoffer i pasientens serum. Denne testen er imidlertid ikke egnet for etterbehandlingsanalyse siden antistoffene forblir lenge etter at bakteriene er ryddet⁸. En annen stor ulempe er at disse metodene bare diagnostiserer H. pylori-infeksjon og ikke tillater resistenstesting for å veilede følsomhetsbasert behandling.

For invasive testmetoder må gastrisk biopsivev tas ved endoskopi og deretter underkastes histologi, urease-hurtigtesten og bakteriekultur. Disse testmetodene er også svært begrensede på grunn av flere faktorer. For tiden er disse teknikkene begrenset til eldre pasienter, pasienter med høy risiko for forstadier eller ondartet sykdom, og pasienter som har mislyktes førstelinjebehandling for gastroøsofageal reflukssykdom eller H. pylori-infeksjon ⁹. For det andre, på grunn av de unike vekstegenskapene til H. pylori, når suksessraten for bakteriekultur bare 50%¹⁰. Dermed gir molekylære deteksjonsmetoder nytt håp for å overvinne de høye kravene til invasive deteksjonsmetoder og veilede følsomhetsbasert behandling. Blant molekylære deteksjonsmetoder har kvantitativ PCR utviklet seg enormt de siste årene. qPCR, i motsetning til tradisjonell PCR, krever ikke gelelektroforese og kvantifiserer nøyaktig DNA / RNA i prøver ved å legge til primere og sonder på glødningsstadiet. qPCR-sett for påvisning av H. pylori-infeksjon og stoffresistens er nå kommersielt tilgjengelige. Likevel har hver metode sine begrensninger; Derfor bør pasientens kliniske diagnose og behandling vurderes i sammenheng med pasientens symptomer, tegn, historie, andre laboratorietester og respons på behandlingen.

For tiden er den primære metoden for behandling av H.pylori-infeksjoner å ta antibiotika, men i det siste blir det stadig vanskeligere å behandle disse infeksjonene på grunn av økningen i antibiotikaresistens. Deretter har en signifikant nedgang i H. pylori-behandlingseffekten blitt observert globalt, noe som gjør H. pylori-utryddelse til et stort folkehelseproblem¹¹.

Klaritromycin og levofloksacin er de to bredspektrede antibiotika som brukes til å behandle infeksjoner forårsaket av H.pylori, men flere studier har rapportert utbredt motstand mot disse to legemidlene i H.pylori-isolater. A2143G, A2142G og A2142C er tre av de mange punktmutasjonene som finnes i 2.9 kb 23S rRNA-genet som resulterer i klaritromycinresistens ved å hindre makrolidet i å binde seg. Samtidig er mutasjonsloci av levofloksacinresistensgenet hovedsakelig lokalisert i de seks mutasjonsstedene (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) av gyrA-genet ¹². Oppdagelsen av disse resistensmekanismene basert på genetiske mutasjoner har ført til et gradvis skifte i påvisning av H. pylori gjennom kulturbaserte studier til molekylær testing.

Samlet sett er det et presserende klinisk behov for en ikke-invasiv, effektiv og samtidig diagnostisk metode for påvisning av H. pylori-infeksjoner og stoffresistens. Vi vedtok en kombinert strengtest og qPCR-metode for å overvinne vanskelighetene med prøvetaking og oppnå målet om samtidig påvisning av H. pylori-infeksjon og medikamentresistens ved hjelp av forskjellige primerprober.

Protocol

Denne studien ble utført i samsvar med etiske hensyn etablert av den etiske komiteen ved Guangdong Provincial People’s Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Kina (godkjenningsnummer: KY-Q-2022-384-02). Pasienter i alderen 18-60 år ble inkludert i denne studien. Pasienter som tok antibiotika, antibakterielle kinesiske legemidler, legemidler som protonpumpehemmere (PPI) eller H2-reseptorantagonister, etc., innen 2 uker før testing, ble ikke inkludert i denne studien. De pasientene som hadde fått…

Representative Results

Påvisning av H. pylori-infeksjon og antibiotikaresistens i magevæske ved qPCRVi utførte qPCR for påvisning av H. pylori-infeksjon ved å amplifisere ureA-genet og bestemte dets antibiotikaresistensprofil ved å målrette punktmutasjoner i 23S rRNA-genet og gyrA-genet (tab 1). CT-verdiene for kvalitetskontroll i alle tre gruppene av qPCR-eksperimentene var innenfor det anbefalte området, noe som indikerte at prøvene alle var i normal tilstand …

Discussion

H. pylori-deteksjon kan utføres ved bruk av både invasive og ikke-invasive metoder¹³. Vanlige invasive teknikker som histopatologi, rask ureasetest, polymerasekjedereaksjon (PCR) og bakteriell dyrking krever endoskopi og biopsi. Serologiske tester, urea-pustetester og enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA) anbefales blant de ikke-invasive prosedyrene¹⁴. Mens ikke-invasive metoder er enkle å utføre, økonomiske og mer komfortable for pasienter, krever isoleri…

Materials

23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent