İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Süspansiyonda Böbrek Organoidlerinin Üretilmesi
Summary
Bu protokol, süspansiyon kültürü koşulları kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) böbrek organoidleri üretmek için kapsamlı ve etkili bir yöntem sunar. Bu çalışmanın birincil vurgusu, başlangıç hücre yoğunluğunun ve WNT agonist konsantrasyonunun belirlenmesinde yatmaktadır, böylece böbrek organoid araştırmalarıyla ilgilenen araştırmacılara fayda sağlamaktadır.
Abstract
Böbrek organoidleri, çeşitli yaklaşımlarla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) üretilebilir. Bu organoidler, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve potansiyel terapötik uygulamalar için büyük umut vaat ediyor. Bu makale, posterior primitif çizgiden (PS) başlayarak orta mezoderme (IM) kadar iPSC’lerden böbrek organoidleri oluşturmak için adım adım bir prosedür sunmaktadır. Yaklaşım, tanımlanmış, hayvansal bileşen içermeyen bir ortam olan APEL 2 ortamına dayanır. 4 gün boyunca yüksek konsantrasyonda WNT agonisti (CHIR99021), ardından fibroblast büyüme faktörü 9 (FGF9) / heparin ve 3 gün boyunca düşük konsantrasyonda CHIR99021 ile desteklenir. Bu işlem sırasında, iPSC’lerin başlangıcında optimal hücre yoğunluğunun ve CHIR99021 konsantrasyonunun seçilmesine önem verilir, çünkü bu faktörler başarılı böbrek organoid üretimi için kritik öneme sahiptir. Bu protokolün önemli bir yönü, IM’nin yavaş yavaş glomerüler, proksimal tübüler ve distal tübüler yapıları kapsayan nefron yapılarına dönüşmesine izin veren düşük yapışık bir plakadaki süspansiyon kültürüdür ve tümü görsel olarak anlaşılabilir bir formatta sunulur. Genel olarak, bu ayrıntılı protokol, çeşitli iPSC’lerden böbrek organoidleri üretmek için verimli ve spesifik bir teknik sunarak başarılı ve tutarlı sonuçlar sağlar.
Introduction
Böbrek, fonksiyonel birimine bağlı olarak fizyolojik homeostazın korunmasında kritik bir rol oynar. Atık ürünleri salgılayan nefronlar, vücut sıvılarının bileşimini düzenleyebilir. Kalıtsal mutasyonların veya diğer yüksek risk faktörlerinin neden olduğu kronik böbrek hastalığı (KBH), sonunda son dönem böbrek hastalığına (SDBH) ilerleyecektir1,2. ESKD, görünüşe göre nefronların sınırlı rejenerasyon kapasitesinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, renal replasman tedavisi gereklidir. İnsan iPSC’lerinin yönlendirilmiş farklılaşması, böbrek gelişimini incelemek, hastaya özgü hastalıkları modellemek ve nefrotoksik ilaç taraması yapmak için kullanılabilen hastaya özgü 3D böbrek organoidlerinin in vitro olarak üretilmesini sağlar 3,4.
Embriyonik gelişim sırasında böbrekler, ilkel çizgiden (PS) farklılaşan ara mezodermden (IM) kaynaklanır. Klasik WNT sinyal yolu, FGF (FGF9, FGF20) ve BMP’nin (JNK aracılığıyla Bmp7 sinyali) koordineli katılımı ile IM’nin ek farklılaşmasına neden olabilir5,6,7. Nefrik progenitör hücrelerin (NPC) iki önemli hücre popülasyonunu üretirler: üreter tomurcuğu (UB) ve metanefrik mezenşim (MM), sırasıyla toplama kanallarını ve nefronu oluşturur 8,9. Her nefron, proksimal ve distal tübüller gibi glomerüler ve tübüler segmentlerden ve Henle10,11 döngüsünden oluşur. Yukarıda bahsedilen teoriye göre, şu anda yayınlanmış protokoller, böbrek organoidlerini indüklemek için sinyal kaskadlarını ve büyüme faktörü stimülasyonunu taklit eder 5,12.
Son birkaç yılda, insan iPSC’lerini böbrek organoidlerineayırmak için birçok protokol geliştirilmiştir 5,6,7,12. Takasato ve ark.7, FGF9 ile değiştirilmeden önce CHIR (WNT agonisti) tedavisinin süresini optimize etti. Protokollerine göre, 4 gün boyunca CHIR maruziyeti, ardından 3 gün boyunca FGF9, iPSC’lerden IM’yi indüklemenin en etkili yoludur. Transwell filtreleri, prosedürlerinde kültür formatı olarak kullanıldı; Ancak, bu yöntem yeni başlayanlar için zordur. Bu nedenle, Kumar ve ark.13 kültür formatını değiştirmeye çalıştı ve kültürü askıya almayı seçti. Yapışık hücreleri, nefron benzeri yapılar içeren embriyoid cisimlere (EB’ler) bir araya gelmelerine yardımcı olmak için düşük yapışkan plakalarda tohumlama için 7. günde ayırdılar. Bununla birlikte, bu yöntemlerin toplu etkisi, özellikle farklı iPSC’lerde belirgindi. Ek olarak, farklı literatürde CHIR konsantrasyonunun 7 μM ile 12 μM arasında değiştiği bildirilmiştir 5,13,14.
Hücre yoğunluğu ve CHIR konsantrasyonunun farklı iPSC’lerde organoid oluşumunu etkileyebileceğini tahmin ettik ve bu, deneylerimizde defalarca doğrulandı. Mevcut protokol, Kumar ve ark.13’ün çalışma yöntemini biraz değiştirmiş ve kullanıcılara adım adım bir prosedür sağlamıştır. Yaklaşımın programı ve şeması Şekil 1’de gösterilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bazal ortamda, başlangıç hücre yoğunluğunda ve CHIR99021 konsantrasyonunda küçük değişiklikler içeren iPSC’lerden böbrek organoidleri üretmek için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Çeşitli deneylerde, başarılı böbrek organoid üretimi için kritik faktörlerin, 7. günde ara mezodermin (IM) ve hücre durumunun ilk farklılaşması olduğu bulunmuştur. Ayrıca, farklı iPSC hatları, hücre proliferasyonu ve farklılaşma potansiyelinde farklılıklar sergiledi, bu da değişen optimal h?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geçmişteki ve günümüzdeki tüm Mao ve Hu Lab üyelerine, ilginç tartışmalar ve projeye büyük katkıları için son derece minnettarız. Ulusal Çocuk Sağlığı Klinik Araştırma Merkezi’ne büyük desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Jianhua Mao’ya U20A20351, Lidan Hu’ya 82200784), Çin’in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. LQ22C070004 Lidan Hu’ya) ve Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. BK20210150 Gang Wang’a).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referências
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease – a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Biologia do Desenvolvimento. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
