Isolering, kultur og adipogen induksjon av stromale vaskulære fraksjonsavledede preadipocytter fra periaortafettvev fra mus

Summary

Her beskriver vi isolasjon, kultur og adipogen induksjon av stromale vaskulære fraksjonsavledede preadipocytter fra periaorta-fettvev fra mus, noe som muliggjør studier av perivaskulær fettvevsfunksjon og dens forhold til vaskulære celler.

Abstract

Perivaskulært fettvev (PVAT) er et fettvevsdepot som omgir blodkar og viser fenotypene til hvite, beige og brune adipocytter. Nylige funn har kastet lys over den sentrale rollen som PVAT i regulering av vaskulær homeostase og deltakelse i patogenesen av kardiovaskulære sykdommer. En helhetlig forståelse av PVAT egenskaper og regulering er av stor betydning for utviklingen av fremtidige terapier. Primærkulturer av periaortaadipocytter er verdifulle for å studere PVAT-funksjonen og krysstalen mellom periaortaadipocytter og karceller. Denne artikkelen presenterer en økonomisk og gjennomførbar protokoll for isolering, kultur og adipogen induksjon av stromale vaskulære fraksjonsavledede preadipocytter fra periaortafettvev fra mus, som kan være nyttig for modellering av adipogenese eller lipogenese in vitro. Protokollen skisserer vevsbehandling og celledifferensiering for dyrking av periaortaadipocytter fra unge mus. Denne protokollen vil gi den teknologiske hjørnesteinen på benksiden for undersøkelsen av PVAT-funksjonen.

Introduction

Perivaskulært fettvev (PVAT), en perivaskulær struktur sammensatt av en blanding av modne adipocytter og en stromal vaskulær fraksjon (SVF), antas å interagere med den tilstøtende karveggen via sitt sekretami parakrensk¹. Som en kritisk regulator av vaskulær homeostase er PVAT-dysfunksjon involvert i patogenesen av kardiovaskulære sykdommer ^2,3,4. SVF for adipocyttvev består av flere forventede cellepopulasjoner, inkludert endotelceller, immunceller, mesotheliumceller, nevronceller og fettstam- og stamceller (ASPCer)^5,6. Det er velkjent at ASPC-er bosatt i SVF av fettvev kan gi opphav til modne adipocytter⁵. SVF antas å være en kritisk kilde til modne adipocytter i PVAT. Flere studier har vist at PVAT-SVF kan differensiere til modne adipocytter under spesifikke induksjonsbetingelser ^6,7,8.

For tiden er det to isolasjonssystemer for å isolere SVF fra fettvev, det ene er enzymatisk fordøyelse og det andre er ikke-enzymatisk⁹. Enzymatiske metoder resulterer vanligvis i et høyere utbytte av kjernefysiske stamceller¹⁰. Hittil har fordelene med SVF for å fremme vaskulær regenerering og neovaskularisering i sårheling, urogenitale og kardiovaskulære sykdommer blitt mye demonstrert¹¹, spesielt i dermatologi og plastikkirurgi^12,13. Imidlertid har de kliniske anvendelsesutsiktene for PVAT-avledet SVF ikke blitt godt utforsket, noe som kan tilskrives mangelen på en standardisert metode for isolering av SVF fra PVAT. Målet med denne protokollen er å etablere en standardisert tilnærming for isolering, kultur og adipogen induksjon av SVF-avledede preadipocytter fra muse-PVAT som omgir thorax aorta, noe som muliggjør videre undersøkelse av PVAT-funksjon. Denne protokollen optimaliserer vevsbehandling og celledifferensieringsteknikker for dyrking av periaortaadipocytter oppnådd fra unge mus.

Protocol

Dyreprotokollene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Shanghai Chest Hospital tilknyttet Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (godkjenningsnummer: KS23010) og var i samsvar med relevante etiske forskrifter. Hann og hunn C57BL/6 mus i alderen 4-8 uker er å foretrekke for dette eksperimentet. 1. Klargjøring av kirurgiske verktøy, buffere og kulturmedier Autoklavkirurgiske verktøy (f.eks. kirurgisk saks og standard tang) ved 12…

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen beskrevet ovenfor isolerte vi nøye PVATer rundt thorax aortaer fra mus (figur 1A-D). Etter vask og hakking av PVATene i små biter med steril saks (figur 1E,F), ble vevsfragmenter fordøyd i en fordøyelsesløsning inneholdende type 1 kollagenase (1 mg/ml) og dispase II (4 mg/ml) og inkubert ved 37 °C på en shaker i 30-45 minutter (figur 1G). Det fo…

Discussion

Vi foreslår en praktisk og gjennomførbar tilnærming for isolering og adipogen induksjon av SVF-avledede preadipocytter fra periaortafettvev fra mus. Fordelene med denne protokollen er at den er enkel og økonomisk. Tilstrekkelig antall mus er avgjørende for vellykket isolasjon, da utilstrekkelig vev kan resultere i lav SVF-tetthet og dårlig veksttilstand, noe som til slutt påvirker lipogen effektivitet. I tillegg er musealder en viktig faktor å vurdere da det adipogene potensialet til SVF avtar med alderen. Rask o…

Materials

0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001