Nethindeproteser har evnen til at generere visuelle opfattelser. For at fremme udviklingen af nye proteser er der behov for ex vivo-metoder til test af enheder før implantation. Denne artikel giver en omfattende protokol til undersøgelse af calciumaktivitet i retinal ganglioncellelag, når de udsættes for elektrisk stimulering.
Retinale dystrofier er en førende årsag til blindhed over hele verden. Der er en omfattende indsats i gang for at udvikle avancerede nethindeproteser, der kan omgå de svækkede lysfølsomme fotoreceptorceller i den degenererede nethinde, med det formål delvist at genoprette synet ved at fremkalde visuelle opfattelser. En almindelig undersøgelsesvej involverer design og produktion af implanterbare enheder med en fleksibel fysisk struktur, der huser et stort antal elektroder. Dette muliggør effektiv og præcis generering af visuelle opfattelser. Med hvert teknologisk fremskridt opstår der imidlertid et behov for en pålidelig og håndterbar ex vivo-metode til at verificere enhedens funktionalitet, inden der går videre til in vivo-eksperimenter , hvor faktorer ud over enhedens ydeevne spiller ind. Denne artikel præsenterer en omfattende protokol til undersøgelse af calciumaktivitet i retinal ganglioncellelag (GCL) efter elektrisk stimulering. Specifikt er følgende trin skitseret: (1) fluorescerende mærkning af rottenthinden ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer, (2) indfangning af fluorescenssignalet ved hjælp af et inverteret fluorescensmikroskop, mens der anvendes forskellige mønstre af elektrisk stimulering og (3) ekstraktion og analyse af calciumsporene fra individuelle celler inden for GCL. Ved at følge denne procedure kan forskere effektivt teste nye stimuleringsprotokoller, inden de udfører in vivo-eksperimenter .
Nethinden indeholder fotoreceptorer, som er celler, der er ansvarlige for at registrere lys. De fanger fotoner og omdanner dem til nerveimpulser. Disse impulser behandles derefter i nethinden og overføres til den visuelle cortex, hvilket resulterer i dannelsen af et visuelt billede1. Retinitis Pigmentosa (RP) og aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er degenerative sygdomme karakteriseret ved det progressive tab af fotoreceptorer. Disse retinopatier er blandt de førende årsager til blindhed på verdensplan1, påvirker millioner af individer og har betydelige medicinske, personlige og socioøkonomiske konsekvenser for patienter, sundhedssystemer og samfundet som helhed. Desuden forventes det med den aldrende befolkning, at AMD-tilfælde vil stige med 15% inden 20502.
I øjeblikket er der adskillige forskningsbestræbelser i gang for at genoprette synet hos patienter, der er ramt af disse tilstande3. En lovende tilgang er brugen af retinale proteser, som har vist sig effektive til delvis at genoprette syn 4,5. Disse enheder fanger lys fra den visuelle scene og konverterer det til elektriske impulser. Disse impulser leveres gennem elektroder i et mikroelektrodearray (MEA) implanteret i øjet, stimulerer de overlevende neuroner og omgår funktionen af de tabte fotoreceptorer. De aktiverede retinale ganglionceller (RGC’er) overfører output til hjernen, hvor det fortolkes som visuel opfattelse. De største begrænsninger ved nuværende implantater ligger imidlertid i opløsningen af elektrodevævsgrænsefladen6 og den ikke-selektive stimulering af forskellige celletyper. For at optimere designet af nye implanterbare enheder til mere effektiv synsgendannelse er det derfor afgørende at forstå, hvordan stimuleringsparadigmer kan udvikles til selektivt at aktivere celler tæt på elektroderne.
Calciumbilleddannelse er en udbredt teknik til undersøgelse af neural aktivitet, der giver flere fordele i forhold til ikke-optiske metoder 7,8. For det første giver det cellulær og subcellulær opløsning. For det andet kan calciummarkører målrette mod specifikke celletyper. For det tredje giver det mulighed for langsigtet sporing, og for det fjerde muliggør det observation af hele cellepopulationer, samtidig med at der skelnes mellem aktive og inaktive celler. Denne metode giver indirekte bevis for cellulær aktivitet med en tidsmæssig opløsning i området hundreder af millisekunder. Genetisk kodede fluorescerende calciumindikatorer, såsom GCaMP-sensorer, gennemgår en konformationsændring ved binding til calcium, hvilket resulterer i øget fluorescens9. Rekombinante adeno-associerede virale vektorer (AAV’er) er et effektivt middel til at transducere retinale celler med GCaMP10.
Denne protokol præsenterer en effektiv metode, der anvender calciumbilleddannelse til test af stimuleringsprotokoller for nethindeimplantater. Specifikt fokuserer vi på ex vivo rotte retinal væv og giver detaljerede trinvise instruktioner, fra prøvetagning til dataanalyse. Ved at tilbyde denne omfattende vejledning kan forskere med forskellige baggrunde gå i gang med elektriske stimuleringseksperimenter med tillid.
Protokollen beskrevet her tjener til at studere calciumdynamikken, der forekommer i rottens retinale GCL ved elektrisk stimulering forsynet med et MEA. Det er en pålidelig og håndterbar metode, men kræver en vis træning, især for ensartet mærkning af GCL effektivt og for at montere nethinden korrekt for at sikre optimal væv-elektrodekontakt. Denne protokol er specifik for gnavere og skal tilpasses, hvis den anvendes på en anden laboratorieart. De kritiske punkter, ændringer og begrænsninger i metoden præsenteres detaljeret.
Intravitreal injektioner
Injektioner anvendes i vid udstrækning til okulær genlevering, hvor intravitreale injektioner er den foretrukne procedure. De har vist sig at være sikrere og mindre invasive sammenlignet med subretinale injektioner, som introducerer molekylerne af interesse direkte mellem fotoreceptorerne og retinale pigmentepitel (RPE), hvilket risikerer nethindeløsning10. Der er dog begrænsninger, især når du udfører disse injektioner i gnavermodeller. Den glasagtige humor er gelatinøs og forhindrer viral diffusion. Desuden er linsen i gnaverøjne stor, hvilket gør det ikke-trivielt at indsætte nålen uden at ridse den. Præcisionssprøjtenålene er sarte og skal udskiftes ofte. For at forhindre obstruktion skal du vaske dem med deioniseret vand før og efter hver brug og udskifte dem regelmæssigt. Derudover injiceres indholdet langsomt for at forhindre opløsningsrefluks og ændringer i intraokulært tryk. At opnå stor og ensartet fluorescens over nethinden kan kræve øvelse.
Transduktion af nethindeceller
Virale vektorer er en fremragende metode til in vivo genlevering, og AAV’er har været meget udbredt til transducing retinale celler10. De er blevet godkendt som en behandling for nogle retinopatier, der forårsager menneskelig blindhed24. Deres transportkapacitet er dog begrænset til 5 kb, inklusive de krævede reguleringselementer (f.eks. promotoren)10,25. Der er flere serotyper tilgængelige, hver med forskellig tropisme. Vælg den bedst egnede AAV baseret på de gener, der skal leveres, og de celler, der skal transduceres26. Til mærkning af RGC’erne anbefales det at bruge AAV227.
Genekspression vindue
Den optimale virale ekspression for AAV2-CAG-GCaMP5G er 2 til 3 uger efter injektion12,18. Ud over denne tidsramme bliver kernerne fra transfekterede celler fluorescerende, celler holder op med at reagere på stimuli og dør i sidste ende 7,28,29. Dette skyldes overekspressionen af GCaMP-indikatoren, som translokeres ind i kernen. Tidsvinduet for optimal genekspression vil variere afhængigt af den virale vektor og den valgte promotor30 og skal bestemmes eksperimentelt, før du fortsætter med denne protokol.
Kontakt mellem væv og elektrode
For optimale og reproducerbare resultater er det afgørende at opnå god væv-elektrodekontakt. Dårlig kontakt skyldes typisk den naturlige krumning af nethinden. En tilgang er at skære nethinden i kvartaler, montere og billede en sektion ad gangen. Små dele af nethinden kan være bedre fladtrykt, hvilket resulterer i mere effektiv kontakt med overfladen af MEA. En anden potentiel årsag til dårlig kontakt er tilstedeværelsen af glasagtig humor. Når du udfører stimuleringseksperimenter, der simulerer et epi-retinal implantat, er det vigtigt omhyggeligt at fjerne glaslegemet humor under retina excision, da det kan fungere som en isolator til strøm. Her beskrives en simpel metode til at kontrollere, om kontakten er tilstrækkelig ved at visualisere elektroden og cellerne i samme brændplan.
Et alternativ til ex vivo retinale målinger er at dyrke neuroner direkte på overfladen af elektroderne. Primær kultur af neuroner, såsom hippocampale neuroner31, kan være nyttige til indledende tests for at evaluere funktionaliteten af den nye stimulerende enhed. Denne tilgang kræver dog stadig brug af forsøgsdyr og repræsenterer ikke kompleksiteten af nethindenetværket, hvilket er vigtigt for evaluering af synaptiske reaktioner på stimulering.
For at visualisere cellerne under elektrode- og elektrodesporene kan MEA’er fremstillet med gennemsigtige materialer såsom indiumtinoxid (ITO) anvendes 19,20,32. Ud over optiske målinger kan GCL-aktivitet ved elektrisk stimulering vurderes gennem elektriske optagelser. MEA kan bruges til at registrere vævets lokale feltpotentiale (LFP). Dette kompromitterer imidlertid rumlig opløsning, da hver elektrode fanger aktivitet fra flere celler samtidigt (afhængigt af elektrodedimensionerne). Optisk optagelse overvinder denne begrænsning og tilbyder kortlægning med højere rumlig opløsning. Dens største fordel er evnen til at skelne mellem aktive og inaktive celler, mens man måler et stort FOV med enkeltcelleopløsning. Blandt alle cellulære aktivitetsreportere er calciumindikatorer velbeskrevne og mest almindeligt anvendte33.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara og Alina Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) for deres tekniske støtte, til Anna Duarri (VHIR, Vall d’Hebron Institute of Research) fra Ophthalmology Research Group for deres støtte med intravitreale injektioner og in vivo retinal billeddannelse.
De finansieringsenheder, der støttede dette arbejde, er: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad – Severo Ochoa-programmet for ekspertisecentre inden for F&U (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya gennem CERCA program; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr. 871124); La Caixa-stiftelsen (LCF/HR19/52160003); og Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | – |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | – |
30 G needle | VWR | 613-5373 | – |
36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | – |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | – |
AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | – | – |
Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | – |
Blade | Swann-morton | 0308 | – |
Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | – |
Carbogen | Air liquide | – | – |
Curved-forceps | – | – | – |
Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | – |
FITC filter cube | Nikon | Standard series | – |
Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | – |
Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | – |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | – |
ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | – |
In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | – |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | – |
Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | – | – |
Long-Evans rat | Janvier | – | – |
MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | – | – |
Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | – |
Methocel 2% | Omni Vision | – | – |
Microelectrode array (MEA) | – | Custom-made | |
NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | – |
Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | – |
Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
Plastic pipette | VWR | 612-1793 | – |
Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | – |
Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | – |
Prescaina | Llorens | – | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | – |
Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | – |
Spring-scissors | FST | 15040-11 | – |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | – |
Straight forceps | FST | 11252-20 | – |
Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | – | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
Washer | Thorlabs | W8S038 | – |