Netthinneproteser har evnen til å generere visuelle oppfatninger. For å fremme utviklingen av nye proteser, er det nødvendig med ex vivo-metoder for å teste enheter før implantasjon. Denne artikkelen gir en omfattende protokoll for å studere kalsiumaktivitet i retinal ganglioncellelaget når de blir utsatt for elektrisk stimulering.
Retinal dystrofier er en ledende årsak til blindhet over hele verden. Omfattende innsats pågår for å utvikle avanserte retinale proteser som kan omgå de svekkede lysfølsomme fotoreceptorcellene i den degenererte netthinnen, med sikte på delvis å gjenopprette syn ved å indusere visuelle percepts. En vanlig undersøkelsesvei innebærer design og produksjon av implanterbare enheter med en fleksibel fysisk struktur, som huser et høyt antall elektroder. Dette muliggjør effektiv og presis generering av visuelle persepter. Men med hver teknologiske fremskritt oppstår det behov for en pålitelig og håndterbar ex vivo-metode for å verifisere funksjonaliteten til enheten før den går videre til in vivo-eksperimenter , hvor faktorer utover enhetens ytelse spiller inn. Denne artikkelen presenterer en omfattende protokoll for å studere kalsiumaktivitet i retinal ganglioncellelaget (GCL) etter elektrisk stimulering. Spesielt er følgende trinn skissert: (1) fluorescerende merking av rottehinnen ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer, (2) fange fluorescenssignalet ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop mens du bruker forskjellige mønstre av elektrisk stimulering, og (3) ekstraherer og analyserer kalsiumsporene fra individuelle celler i GCL. Ved å følge denne prosedyren kan forskere effektivt teste nye stimuleringsprotokoller før de utfører in vivo-eksperimenter .
Netthinnen inneholder fotoreceptorer, som er celler som er ansvarlige for å føle lys. De fanger fotoner og konverterer dem til nerveimpulser. Disse impulsene behandles deretter i netthinnen og overføres til den visuelle cortex, noe som resulterer i dannelsen av et visuelt bilde1. Retinitis pigmentosa (RP) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er degenerative sykdommer preget av progressivt tap av fotoreceptorer. Disse retinopatiene er blant de ledende årsakene til blindhet over hele verden1, påvirker millioner av individer og har betydelige medisinske, personlige og sosioøkonomiske konsekvenser for pasienter, helsevesen og samfunnet som helhet. Videre, med den aldrende befolkningen, anslås det at AMD-tilfeller vil øke med 15% innen 20502.
For tiden pågår det en rekke forskningsinnsats for å gjenopprette syn hos pasienter som er rammet av disse tilstandene3. En lovende tilnærming er bruken av retinalproteser, som har vist effektivitet i delvis gjenoppretting av visjon 4,5. Disse enhetene fanger lys fra den visuelle scenen og konverterer den til elektriske pulser. Disse pulsene leveres gjennom elektroder i en mikroelektrodegruppe (MEA) implantert i øyet, stimulerer de overlevende nevronene og omgår funksjonen til de tapte fotoreceptorene. De aktiverte retinale ganglioncellene (RGC) overfører utgangen til hjernen, hvor den tolkes som visuell oppfatning. Imidlertid ligger de viktigste begrensningene for nåværende implantater i oppløsningen av elektrodevevgrensesnittet6 og ikke-selektiv stimulering av forskjellige celletyper. Derfor, for å optimalisere utformingen av nye implanterbare enheter for mer effektiv visjonsrestaurering, er det avgjørende å forstå hvordan stimuleringsparadigmer kan utvikles for å selektivt aktivere celler i nærheten av elektrodene.
Kalsiumavbildning er en mye brukt teknikk for å studere nevral aktivitet, og tilbyr flere fordeler i forhold til ikke-optiske metoder 7,8. For det første gir den cellulær og subcellulær oppløsning. For det andre kan kalsiummarkører målrette mot bestemte celletyper. For det tredje tillater det langsiktig sporing, og for det fjerde muliggjør det observasjon av hele cellepopulasjoner mens man skiller mellom aktive og inaktive celler. Denne metoden gir indirekte bevis på cellulær aktivitet med en tidsmessig oppløsning i området hundrevis av millisekunder. Genetisk kodede fluorescerende kalsiumindikatorer, som GCaMP-sensorer, gjennomgår en konformasjonsendring ved binding til kalsium, noe som resulterer i økt fluorescens9. Rekombinante adenoassosierte virale vektorer (AAV) er et effektivt middel for å transdusere retinale celler med GCaMP10.
Denne protokollen presenterer en effektiv metode som benytter kalsiumavbildning for å teste stimuleringsprotokoller av retinalimplantater. Spesielt fokuserer vi på ex vivo rotte retinal vev og gir detaljerte trinnvise instruksjoner, fra prøveinnsamling til dataanalyse. Ved å tilby denne omfattende veiledningen kan forskere fra ulike bakgrunner begynne på elektrisk stimuleringseksperimentering med tillit.
Protokollen beskrevet her tjener til å studere kalsiumdynamikken som forekommer i rotte retinal GCL ved elektrisk stimulering forsynt med en MEA. Det er en pålitelig og håndterbar metode, men krever litt trening, spesielt for å merke GCL jevnt effektivt og for å montere netthinnen riktig for å sikre optimal vev-elektrodekontakt. Denne protokollen er spesifikk for gnagere og må tilpasses hvis den brukes på en annen laboratorieart. De kritiske punktene, modifikasjonene og begrensningene i metodikken presenteres i detalj.
Intravitreale injeksjoner
Injeksjoner er mye brukt for okulær genlevering, med intravitreale injeksjoner som den foretrukne prosedyren. De har vist seg å være tryggere og mindre invasive sammenlignet med subretinale injeksjoner, som introduserer molekylene av interesse direkte mellom fotoreceptorene og retinalpigmentepitelet (RPE), og risikerer retinal detachment10. Det er imidlertid begrensninger, spesielt når du utfører disse injeksjonene i gnagermodeller. Den glassaktige humoren er gelatinøs, og hindrer viral diffusjon. Dessuten er linsen i gnagerøyne stor, noe som gjør det ikke-trivielt å sette inn nålen uten å skrape den. Presisjonssprøytenålene er ømfintlige og må byttes ofte. For å unngå hindring, vask dem med avionisert vann før og etter hver bruk og bytt dem regelmessig. I tillegg injiser innholdet sakte for å forhindre refluks og endringer i intraokulært trykk. Å oppnå stor og jevn fluorescens over netthinnen kan kreve øvelse.
Retinal celletransduksjon
Virale vektorer er en utmerket metode for in vivo genlevering, og AAV har blitt mye brukt for å transdusere retinale celler10. De har blitt godkjent som behandling for noen retinopatier som forårsaker menneskelig blindhet24. Imidlertid er deres bærekapasitet begrenset til 5 kb, inkludert de nødvendige regulatoriske elementene (f.eks. promotoren) 10,25. Det er flere serotyper tilgjengelig, hver med forskjellig tropisme. Velg den best egnede AAV basert på genene som skal leveres og cellene som skal transduseres26. For merking av RGC anbefales det å bruke AAV227.
Vinduet Genuttrykk
Det optimale virale uttrykket for AAV2-CAG-GCaMP5G er 2 til 3 uker etter injeksjon12,18. Utover den tidsrammen blir kjernene fra transfekterte celler fluorescerende, celler slutter å reagere på stimuli, og til slutt dør 7,28,29. Dette skyldes overekspresjonen av GCaMP-indikatoren, som omplasseres til kjernen. Tidsvinduet for optimalt genuttrykk vil variere avhengig av virusvektoren og den valgte promotoren30 og må bestemmes eksperimentelt før du fortsetter med denne protokollen.
Vev-elektrode kontakt
For optimale og reproduserbare resultater er det avgjørende å oppnå god vev-elektrodekontakt. Dårlig kontakt skyldes vanligvis den naturlige krumningen i netthinnen. En tilnærming er å kutte netthinnen i kvartaler, montere og avbilde en seksjon om gangen. Små deler av netthinnen kan bli bedre flatt, noe som resulterer i mer effektiv kontakt med overflaten av MEA. En annen potensiell årsak til dårlig kontakt er tilstedeværelsen av glassaktig humor. Når du utfører stimuleringseksperimenter som simulerer et epi-retinalt implantat, er det viktig å forsiktig fjerne glasslegemet under retina-eksisjon, da det kan fungere som en isolator for strøm. Her beskrives en enkel metode for å sjekke om kontakten er tilstrekkelig ved å visualisere elektroden og cellene i samme fokalplan.
Et alternativ til ex vivo retinal målinger er å vokse nevroner direkte på overflaten av elektrodene. Primærkultur av nevroner, som hippocampus-nevroner31, kan være nyttig for innledende tester for å evaluere funksjonaliteten til den nye stimulerende enheten. Imidlertid krever denne tilnærmingen fortsatt bruk av laboratoriedyr og representerer ikke kompleksiteten til retinalnettverket, noe som er viktig for å evaluere synaptiske responser på stimulering.
For å visualisere cellene under elektrode- og elektrodesporene, kan MEAer fremstilt med gjennomsiktige materialer som indiumtinnoksid (ITO) brukes 19,20,32. I tillegg til optiske målinger kan GCL-aktivitet ved elektrisk stimulering vurderes gjennom elektriske opptak. MEA kan brukes til å registrere det lokale feltpotensialet (LFP) til vevet. Dette kompromitterer imidlertid romlig oppløsning, da hver elektrode fanger aktivitet fra flere celler samtidig (avhengig av elektrodedimensjonene). Optisk opptak overvinner denne begrensningen og tilbyr kartlegging med høyere romlig oppløsning. Den største fordelen er evnen til å skille mellom aktive og inaktive celler mens du måler en stor FOV med enkeltcelleoppløsning. Blant alle cellulære aktivitetsreportere er kalsiumindikatorer godt beskrevet og mest brukte33.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara og Alina Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) for deres tekniske støtte, til Anna Duarri (VHIR, Vall d’Hebron Institute of Research) fra Ophthalmology Research Group for deres støtte med intravitreale injeksjoner og in vivo retinal imaging.
Finansieringsenhetene som støttet dette arbeidet er: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad – Severo Ochoa-programmet for sentre for fremragende forskning og utvikling (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya gjennom CERCA-programmet; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr. 871124); La Caixa Foundation (LCF / HR19 / 52160003); og Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | – |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | – |
30 G needle | VWR | 613-5373 | – |
36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | – |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | – |
AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | – | – |
Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | – |
Blade | Swann-morton | 0308 | – |
Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | – |
Carbogen | Air liquide | – | – |
Curved-forceps | – | – | – |
Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | – |
FITC filter cube | Nikon | Standard series | – |
Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | – |
Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | – |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | – |
ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | – |
In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | – |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | – |
Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | – | – |
Long-Evans rat | Janvier | – | – |
MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | – | – |
Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | – |
Methocel 2% | Omni Vision | – | – |
Microelectrode array (MEA) | – | Custom-made | |
NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | – |
Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | – |
Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
Plastic pipette | VWR | 612-1793 | – |
Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | – |
Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | – |
Prescaina | Llorens | – | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | – |
Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | – |
Spring-scissors | FST | 15040-11 | – |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | – |
Straight forceps | FST | 11252-20 | – |
Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | – | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
Washer | Thorlabs | W8S038 | – |