विद्युत रूप से उत्तेजित फ्लैट-माउंटेड रेटिना में कैल्शियम इमेजिंग

Summary

रेटिना कृत्रिम अंग में दृश्य धारणा उत्पन्न करने की क्षमता होती है। नए कृत्रिम अंग के विकास को आगे बढ़ाने के लिए, आरोपण से पहले उपकरणों का परीक्षण करने के लिए पूर्व विवो विधियों की आवश्यकता होती है। यह लेख विद्युत उत्तेजना के अधीन होने पर रेटिना गैंग्लियन सेल परत में कैल्शियम गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Abstract

रेटिना डिस्ट्रोफी दुनिया भर में अंधापन का एक प्रमुख कारण है। उन्नत रेटिना कृत्रिम अंग विकसित करने के लिए व्यापक प्रयास चल रहे हैं जो पतित रेटिना में बिगड़ा हुआ प्रकाश-संवेदन फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को बायपास कर सकते हैं, जिसका लक्ष्य दृश्य धारणाओं को प्रेरित करके दृष्टि को आंशिक रूप से बहाल करना है। जांच के एक आम एवेन्यू डिजाइन और एक लचीला भौतिक संरचना के साथ प्रत्यारोपण उपकरणों के उत्पादन शामिल, इलेक्ट्रोड की एक उच्च संख्या आवास. यह दृश्य धारणाओं की कुशल और सटीक पीढ़ी को सक्षम बनाता है। हालांकि, प्रत्येक तकनीकी प्रगति के साथ, विवो प्रयोगों में प्रगति करने से पहले डिवाइस की कार्यक्षमता को सत्यापित करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रबंधनीय पूर्व विवो विधि की आवश्यकता होती है, जहां डिवाइस के प्रदर्शन से परे कारक खेल में आते हैं। यह लेख विद्युत उत्तेजना के बाद रेटिना गैंग्लियन सेल परत (जीसीएल) में कैल्शियम गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। विशेष रूप से, निम्नलिखित चरणों को रेखांकित किया गया है: (1) आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके चूहे रेटिना को फ्लोरोसेंटली लेबलिंग, (2) विद्युत उत्तेजना के अलग-अलग पैटर्न लागू करते समय एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रतिदीप्ति संकेत पर कब्जा करना, और (3) जीसीएल के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं से कैल्शियम के निशान निकालना और विश्लेषण करना। इस प्रक्रिया का पालन करके, शोधकर्ताओं कुशलतापूर्वक विवो प्रयोगों में आयोजित करने से पहले नए उत्तेजना प्रोटोकॉल का परीक्षण कर सकते हैं.

Introduction

रेटिना में फोटोरिसेप्टर होते हैं, जो प्रकाश को महसूस करने के लिए जिम्मेदार कोशिकाएं होती हैं। वे फोटॉन को पकड़ते हैं और उन्हें तंत्रिका आवेगों में परिवर्तित करते हैं। इन आवेगों को तब रेटिना के भीतर संसाधित किया जाता है और दृश्य प्रांतस्था में प्रेषित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक दृश्य छवि¹ का निर्माण होता है। रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) और आयु से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) अपक्षयी रोग हैं जो फोटोरिसेप्टर के प्रगतिशील नुकसान की विशेषता हैं। ये रेटिनोपैथी दुनिया भर में अंधेपन के प्रमुख कारणों में से हैं¹, लाखों व्यक्तियों को प्रभावित करते हैं और रोगियों, स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों और समाज के लिए महत्वपूर्ण चिकित्सा, व्यक्तिगत और सामाजिक आर्थिक परिणाम होते हैं। इसके अलावा, उम्र बढ़ने की आबादी के साथ, यह अनुमान लगाया गया है कि 2050 तक एएमडी के मामलों में 15% की वृद्धि^{होगी।}

वर्तमान में, इन स्थितियों से प्रभावित रोगियों में दृष्टि बहाल करने के लिए कई शोध प्रयास चल रहे हैं³. एक आशाजनक दृष्टिकोण रेटिना कृत्रिम अंग, जो आंशिक रूप से दृष्टि ^4,5 बहाल करने में प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है का उपयोग है. ये उपकरण दृश्य दृश्य से प्रकाश को पकड़ते हैं और इसे विद्युत दालों में परिवर्तित करते हैं। इन दालों को आंखों में प्रत्यारोपित माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) के भीतर इलेक्ट्रोड के माध्यम से वितरित किया जाता है, जीवित न्यूरॉन्स को उत्तेजित करता है और खोए हुए फोटोरिसेप्टर के कार्य को दरकिनार करता है। सक्रिय रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी) आउटपुट को मस्तिष्क तक पहुंचाती हैं, जहां इसे दृश्य धारणा के रूप में व्याख्या की जाती है। हालांकि, वर्तमान प्रत्यारोपण की मुख्य सीमाएं इलेक्ट्रोड-ऊतक इंटरफ़ेस⁶ के संकल्प और विभिन्न सेल प्रकारों के गैर-चयनात्मक उत्तेजना में निहित हैं। इसलिए, अधिक कुशल दृष्टि बहाली के लिए नए प्रत्यारोपण योग्य उपकरणों के डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए, यह समझना महत्वपूर्ण है कि इलेक्ट्रोड के करीब निकटता में कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से सक्रिय करने के लिए उत्तेजना प्रतिमान कैसे विकसित किए जा सकते हैं।

कैल्शियम इमेजिंग तंत्रिका गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से नियोजित तकनीक है, जो गैर-ऑप्टिकल तरीकों ^7,8 पर कई फायदे प्रदान करती है। सबसे पहले, यह सेलुलर और उपकोशिकीय संकल्प प्रदान करता है। दूसरे, कैल्शियम मार्कर विशिष्ट सेल प्रकारों को लक्षित कर सकते हैं। तीसरा, यह दीर्घकालिक ट्रैकिंग की अनुमति देता है, और चौथा, यह सक्रिय और निष्क्रिय कोशिकाओं के बीच अंतर करते हुए संपूर्ण सेल आबादी के अवलोकन को सक्षम बनाता है। यह विधि सैकड़ों मिलीसेकंड की सीमा में एक अस्थायी संकल्प के साथ सेलुलर गतिविधि का अप्रत्यक्ष प्रमाण प्रदान करती है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक, जैसे GCaMP सेंसर, कैल्शियम के लिए बाध्यकारी पर एक संरूपण परिवर्तन से गुजरते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति⁹ बढ़ जाती है। पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर (एएवी) जीसीएएमपी¹⁰ के साथ रेटिना कोशिकाओं को स्थानांतरित करने का एक प्रभावी साधन हैं।

यह प्रोटोकॉल एक कुशल विधि प्रस्तुत करता है जो रेटिना प्रत्यारोपण के उत्तेजना प्रोटोकॉल के परीक्षण के लिए कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करता है। विशेष रूप से, हम पूर्व विवो चूहे रेटिना ऊतक पर ध्यान केंद्रित करते हैं और नमूना अधिग्रहण से लेकर डेटा विश्लेषण तक विस्तृत चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करते हैं। इस व्यापक गाइड की पेशकश करके, विभिन्न पृष्ठभूमि के शोधकर्ता आत्मविश्वास के साथ विद्युत उत्तेजना प्रयोग शुरू कर सकते हैं।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाएं मानक पशु नैतिक दिशानिर्देशों (यूरोपीय समुदाय निर्देश 86/609 / ईयू) के अनुसार आयोजित की गईं और स्थानीय पशु नैतिकता समितियों द्वारा अनुमोदित की गईं। वर्तमान अध्ययन के लिए 8 सप्ताह पुराने लांग इवांस चूहों का उपयोग किया गया था। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)। 1. मीडिया और फ्लैट-माउंटिंग असेंबली की तैयारी एम्स का मध्यम (1 एल)1 एल कांच की बोतल में, एम्स के मध्यम पाउडर, 1.9 ग्राम/एल नाएचसीओ3, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन 100x के 10 मिलीलीटर, और 1 एल विआयनीकृत पानी ( सामग्री की तालिकादेखें) को मिलाएं। पीएच को 7.4 और परासरण को 280 mOsm को विआयनीकृत पानी या NaHCO3 के साथ समायोजित करें। एक हुड के नीचे एक 0.2 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर के माध्यम से यह छानने के द्वारा समाधान जीवाणु.नोट: निष्फल माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह समाधान स्थिर रहता है और इसे 1 महीने तक इस्तेमाल किया जा सकता है। बढ़ते झिल्लीगोंद की छोटी बूंदों का उपयोग करके वॉशर को एक PTFE झरझरा झिल्ली ( सामग्री की तालिकादेखें) संलग्न करें। इसे कम से कम 15 मिनट तक सूखने दें। पारभासी प्राप्त करने के लिए, झिल्ली को 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जित करें। पूरी तरह से इथेनॉल को हटाने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ झिल्ली को दो बार कुल्ला। अस्पष्टता को रोकने के लिए उन्हें विआयनीकृत पानी में स्टोर करें। 2. जीसीएल लेबलिंग और चूहा रेटिना फ्लैट-माउंटिंग नोट: यह लेबलिंग विधि विस्थापित एमाक्रिन कोशिकाओं से आरजीसी को अलग नहीं करती है। यदि आरजीसी की चयनात्मक लेबलिंग वांछित है, तो ऑप्टिक तंत्रिका12 के माध्यम से आरजीसी-विशिष्ट प्रमोटरों11 और / या प्रतिगामी लेबलिंग के साथ एएवी का उपयोग करने पर विचार करें। पर और ऑफ-सेंटर आरजीसी के वर्गों के बीच भेदभाव करने के लिए, उनके प्रकाश प्रतिक्रिया13,14 के आधार पर आरजीसी वर्गीकृत, और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों है कि वृद्धि संवेदनशीलता और एकल कार्रवाई क्षमता15 को मापने की क्षमता प्रदान के नए संस्करणों का उपयोग. इंट्राविट्रियल इंजेक्शन8 सप्ताह के लॉन्ग इवांस चूहे को 2% आइसोफ्लुरेन / 1% ओ2 के साथ एनेस्थेटाइज़ करें जब तक कि कोई पेडल रिफ्लेक्स न हो, और चूहे के नाक के मुखौटे के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।नोट: संज्ञाहरण के दौरान, शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर पशु स्थिति. पुतली को फैलाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आई ड्रॉप ( सामग्री की तालिकादेखें) की एक बूंद का प्रशासन करें। सर्जरी के साथ आगे बढ़ने से पहले, विवो रेटिना इमेजिंग सिस्टम में फंडोस्कोपी और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (ओसीटी) का उपयोग करके असामान्यताओं के लिए आंख की जांच करें। कॉर्निया-उद्देश्य संपर्क की सुविधा के लिए मेथोकेल 2% की एक बूंद लागू करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।नोट: यदि किसी भी असामान्यताओं का पता चला है, तो उस आंख के लिए बाद के चरणों के साथ आगे न बढ़ें। एक स्थानीय संवेदनाहारी के रूप में प्रेस्केन की एक बूंद लागू करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिवनी फिलामेंट के साथ पलक और लिम्बल कंजाक्तिवा को ठीक करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक 30 जी सुई का उपयोग कर अंग से एक 1 मिमी स्क्लेरोटॉमी 4 मिमी बनाएँ.एक सटीक सिरिंज के लिए एक 36 जी कुंद सुई संलग्न करें और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक को 45 डिग्री कोण पर 30 एस के लिए कांच में ले जाने वाले एएवी कणों को इंजेक्ट करें। इस अध्ययन में, हमने AAV2-CAG-GCaMP5G (HBSS में 7.5 x 1011 GC/mL) ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया।नोट: एएवी निर्माण जो संभावित ट्यूमरजेनिक जीन उत्पादों या विष अणुओं को सांकेतिक शब्दों में बदलना नहीं करते हैं और एक सहायक वायरस के बिना उत्पादित होते हैं, जैव सुरक्षा स्तर 1 (बीएसएल-1) सुविधाओं में नियंत्रित किया जा सकता है। अन्यथा, यदि बीएसएल-2 रोकथाम के अंतर्गत जैव-खतरनाक सामग्री समळाा जाता है तो उचितसावधानी बरती जानी चाहिए। GCaMP के लिए AAV एन्कोडिंग को BSL-1 माना जाता है और जैव सुरक्षा अलमारियाँ के तहत हेरफेर की आवश्यकता नहीं होती है। सूजन को रोकने के लिए और एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस के रूप में टोब्रैडेक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) की एक बूंद लागू करें। यदि वांछित हो, तो दूसरी आंख के साथ चरण 2, 3 और 4 दोहराएं।नोट: जानवरों पर जाँच 12-24 सर्जरी के बाद घंटे सुनिश्चित करने के लिए वहाँ कोई प्रतिकूल प्रतिक्रिया कर रहे हैं. इंजेक्शन के तीन दिन बाद, विवो रेटिना इमेजिंग सिस्टम में फंडोस्कोपी और ओसीटी का उपयोग करके रेटिना संरचना की जांच करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, जीसीएल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करना चाहिए। विवो रेटिना इमेजिंग सिस्टम में एक का उपयोग करके प्रतिदीप्ति फंडोस्कोपी द्वारा रेटिना संरचना और एएवी अभिव्यक्ति का आकलन करें।नोट: वेइट्ज़ एट अल 12 के अनुसार, एएवी 2-सीएजी-जीसीएएमपी 5 जी से प्रतिदीप्ति 1 सप्ताह के बाद इंजेक्शन पर ध्यान देने योग्य हो जाती है और 2 सप्ताह तक तेज हो जाती है। चौथे सप्ताह से शुरू होकर, GCaMP की अतिअभिव्यक्ति साइटोमोर्बिडिटी को प्रेरित करती है। मरने वाली कोशिकाएं नाभिक और साइटोप्लाज्म में एक उच्च आधारभूत प्रतिदीप्ति संकेत प्रदर्शित करती हैं जो उत्तेजना के जवाब में उतार-चढ़ाव नहीं करती हैं। स्वस्थ कोशिकाओं में, GCaMP अभिव्यक्ति साइटोप्लाज्म तक ही सीमित है और नाभिक 7,8,12,17,18 से बाहर रखा गया है। इन सुविधाओं को माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के दौरान पूर्व विवो देखा जा सकता है। जीन अभिव्यक्ति की खिड़की वायरल वेक्टर और चुने हुए प्रमोटर के आधार पर भिन्न हो सकती है। रेटिना छांटना और फ्लैट-माउंटिंगनोट: इंजेक्शन के दो से तीन सप्ताह बाद, इंट्राविट्रियल-इंजेक्शन वाले चूहों को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल शुरू होने से तुरंत पहले इच्छामृत्यु दी जाती है, मानक नैतिक दिशानिर्देशों (यूरोपीय समुदाय निर्देश 86/609 / ईयू) के अनुसार और स्थानीय नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित। कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) साँस लेना इस प्रोटोकॉल में इच्छामृत्यु की विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है.नेत्र संकेंद्रीकरणधीरे थोड़ा आंख सॉकेट से आंख फैलाना करने के लिए घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कक्षा के बाहरी प्रेस. आंख को पकड़ने वाली मांसपेशियों को काटने और इसे एन्यूक्लियेट करने के लिए स्प्रिंग कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें, ध्यान रखें कि नेत्रगोलक पंचर न हो।नोट: इस चरण से शुरू, ऑक्सीजन युक्त (95% ओ2 /5% सीओ2) एम्स के माध्यम में एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत रेटिना काटना। रेटिना छांटनानेत्रगोलक से आसपास के सभी ऊतकों को हटाने के लिए छोटे घुमावदार संदंश और ठीक वसंत कैंची की एक जोड़ी का प्रयोग करें. लगभग 3 सेमी x 3 सेमी फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा लें और इसे 3.5 सेमी डिश के ढक्कन पर रखें। एम्स के माध्यम के साथ कागज भिगोएँ। नेत्रगोलक को कागज के ऊपर रखें, जिसमें पूर्वकाल खंड ऑपरेटर का सामना कर रहा हो। नेत्रगोलक पकड़ करने के लिए सीधे संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग करें, उन्हें पकवान की सतह से लगभग एक 45 डिग्री कोण पर ओरा सेराटा के शीर्ष पर स्थिति. एक संदर्भ के रूप में सीधे संदंश के बीच की जगह का उपयोग करके, एक ब्लेड के साथ एक छोटा सा कटौती करें। एम्स के माध्यम में नेत्रगोलक की प्रतिपूर्ति करें। आंख के पूर्वकाल और पीछे के खंडों को अलग करने के लिए सीधे संदंश और ठीक वसंत कैंची की एक जोड़ी का प्रयोग करें। ध्यान से सीधे संदंश के दो जोड़े का उपयोग लेंस हटा दें. फिर, श्वेतपटल से रेटिना को अलग करें। ठीक वसंत कैंची का उपयोग ऑप्टिक तंत्रिका की ओर श्वेतपटल काटें जब तक कि रेटिना eyecup से अलग है. सबसे अच्छा कैल्शियम सूचक अभिव्यक्ति के साथ रेटिना के क्षेत्र की पहचान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें.नोट: वायरल प्रसार की सीमा इंट्राविट्रियल इंजेक्शन की सफलता पर निर्भर करती है। रेटिना के बड़े हिस्से में प्रतिदीप्ति को प्राप्त करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है। अन्वेषक का अनुभव इष्टतम परिणाम प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक कट-टिप प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग, बढ़ते झिल्ली (बढ़ते झिल्ली कदम) पर रेटिना के चयनित टुकड़ा हस्तांतरण. सीधे संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग करने के लिए फ्लैट जीसीएल का सामना करना पड़ के साथ रेटिना माउंट. एक 100 माइक्रोन विंदुक टिप से जुड़ी एक प्लास्टिक विंदुक के साथ, रेटिना टुकड़ा झरझरा झिल्ली का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए मीडिया को हटा दें. विदेश मंत्रालय पर विधानसभा फ्लिप इतना है कि जीसीएल इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर टिकी हुई है. ऑक्सीजन युक्त एम्स के माध्यम के साथ नमूना स्नान भरें। 3. विद्युत उत्तेजना पर पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग नोट: इस काम में, पूर्व विवो प्रयोग के लिए एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट एमईए का उपयोग किया गया था। कस्टम एमईए को टीआई / एयू ट्रेस के साथ 500 माइक्रोन मोटी बोरोसिलिकेट ग्लास पर 25 माइक्रोन व्यास झरझरा ग्राफीन-आधारित इलेक्ट्रोड के साथ निर्मित किया गया था और बाद में सिलिकॉन नाइट्राइड और एसयू -8 फोटोरेसिस्ट12 के साथ अछूता रखा गया था। हालांकि, कैल्शियम इमेजिंग विधियां उत्तेजना के लिए उपयोग की जाने वाली इलेक्ट्रोड सामग्री के बावजूद मान्य हैं। छिड़काव प्रणाली सेट तो ऑक्सीजन युक्त एम्स ‘मध्यम लगातार 5 एमएल / मिनट की एक निरंतर प्रवाह दर पर 33 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्नान perfuses. एक फ्लोरोसेंट लैंप, एक FITC फिल्टर घन, और एक CMOS कैमरा के साथ सुसज्जित एक उलटा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रयोग, उत्तेजक इलेक्ट्रोड और GCaMP व्यक्त कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति दिखाई दे रहे हैं, जहां एक क्षेत्र के लिए रेटिना का निरीक्षण. इस अध्ययन के लिए एक 20x NA 0.75 वायु उद्देश्य का उपयोग किया गया था।नोट: इलेक्ट्रोड के साथ कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से उत्तेजित (और रिकॉर्ड) करने के लिए, रेटिना और इलेक्ट्रोड को निकट संपर्क में होना चाहिए। इस प्रकार, कोशिकाएं इलेक्ट्रोड के समान फोकल विमान में स्पष्ट रूप से होती हैं। यदि ऐसा नहीं है, तो चरण 8 से रेटिना छांटना के चरणों को दोहराएं। स्वस्थ पशु मॉडल (कार्यशील फोटोरिसेप्टर के साथ) से रेटिना का उपयोग करते समय, ध्यान दें कि हर बार फ्लोरोसेंट लैंप चालू होता है, प्रकाश द्वारा उत्पन्न कुछ विकसित प्रतिक्रियाएं होंगी क्योंकि रेटिना GCaMP सेंसर को रोमांचक बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली तरंग दैर्ध्य के प्रति प्रकाश-संवेदनशील है। इन प्रकाश-प्रेरित कैल्शियम परिवर्तनों का उपयोग ऊतक की स्वास्थ्य स्थिति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। विद्युत evoked प्रतिक्रियाओं के साथ प्रकाश मिश्रण से बचने के लिए, फ्लोरोसेंट दीपक छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले कम से कम 1 मिनट पर बारी. जीसीएल में विद्युत विकसित प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए, वर्तमान-नियंत्रित दालों को भेजने के लिए एक इलेक्ट्रोड का चयन करें। पल्स जनरेटर डिवाइस के सॉफ्टवेयर में विद्युत उत्तेजना पैरामीटर सेट करें, जैसे: आकार, आयाम, अवधि, चरण देरी, और लागू होने वाली दालों की आवृत्ति।नोट: प्रभावी उत्तेजना पैरामीटर 50 μs से 100 ms की पल्स चौड़ाई से व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं, जिसमें आयाम 0.1 μA से 10 μA तक होते हैं। ये पैरामीटर, उत्तेजना आवृत्ति, उत्तेजना ध्रुवीयता, दालों की संख्या, और इंटरफेज़ देरी के साथ, कैल्शियम इमेजिंग 19,20,21,22द्वारा देखे गए स्थानिक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। 1 एमएस, 2 μA उत्तेजना देने वाले 40 द्विध्रुवीय दालों की एक ट्रेन अक्सर लेबल न्यूरॉन्स में एक दृश्य प्रतिक्रिया उत्पन्न करती है। उत्तेजना वितरण के साथ छवि अधिग्रहण सिंक्रनाइज़ करने के लिए, छवि अधिग्रहण की शुरुआत को नियंत्रित करने के लिए एक बाहरी ट्रिगर के रूप में पल्स जनरेटर का उपयोग करें. आउटपुट ट्रिगर सिग्नल का उपयोग करके कैमरे को पल्स जनरेटर से कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और कैमरा सॉफ़्टवेयर के “कैप्चर मोड” को “बाहरी स्टार्ट ट्रिगर” पर सेट करें। कैमरा सॉफ़्टवेयर में स्टार्ट दबाएं ताकि यह शुरू होने के लिए बाहरी ट्रिगर की प्रतीक्षा करे। पल्स जनरेटर सॉफ्टवेयर के साथ छवि अधिग्रहण शुरू करें।नोट: बाहरी ट्रिगर नियंत्रण अलग-अलग कैमरों के लिए अलग-अलग सेट किया जा सकता है। इस अध्ययन ने आम तौर पर छवियों (512 x 512 पिक्सल, 16-बिट ग्रेस्केल) को 1 मिनट के लिए 10 फ्रेम प्रति सेकंड पर हासिल किया, जबकि हर 10 एस में द्विध्रुवीय पल्स ट्रेनों के फटने प्रदान किए। पल्स वितरण 10 एस के बाद शुरू होता है, तो सभी प्रयोगों में पहले फ्रेम सहज गतिविधि के अनुरूप है. GCaMP सेंसर और विश्लेषण के आधार पर एक प्रदर्शन करेगा, किसी को आपके कैल्शियम संकेतक8 के उदय और क्षय समय के अनुसार रिकॉर्डिंग दर को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। कैल्शियम सूचक15 की एकल कार्रवाई क्षमता का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता पर विचार करें. छवियों को एक फ़ाइल नाम के साथ सहेजें जिसमें लागू विद्युत उत्तेजना पैरामीटर शामिल हैं, जैसे [इलेक्ट्रोड संख्या]_ [पल्स आयाम]_ [पल्स अवधि]_ [पल्स फ्रीक्वेंसी]_Image001। 4. डेटा विश्लेषण ImageJ/FIJI समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल और सेल सोमास से स्थानिक निर्देशांक निकालने के लिएरुचि के क्षेत्र (आरओआई) को “क्षेत्र चयन उपकरण” के साथ विभाजित करें और इसे आरओआई प्रबंधक (आरओआई प्रबंधक > जोड़ें) > विश्लेषण > उपकरण जोड़ें) में जोड़ें। ROI प्रबंधक मेनू से, इसे .zip फ़ोल्डर के रूप में सहेजें (अधिक > सहेजें)।नोट: आमतौर पर, एक ही आरओआई को सभी उत्तेजना प्रयोगों पर लागू किया जा सकता है क्योंकि वे एक ही एफओवी के अनुरूप होते हैं। निकाले जाने वाले पैरामीटर के रूप में “मीन ग्रे वैल्यू” का चयन करें (माप का विश्लेषण > सेट करें)। एकाधिक उपाय पर क्लिक करके सेल somas से “मतलब ग्रे मान” निकालें > अधिक. एक डायलॉग बॉक्स दिखाई देगा। सक्षम करें सभी 600 स्लाइस और एक पंक्ति प्रति टुकड़ा विकल्प एक एकल तालिका प्राप्त करने के लिए जिसमें कॉलम ROI के अनुरूप हैं और पंक्तियाँ समय सीमा के अनुरूप हैं। जनरेट की गई तालिका को .xls स्प्रेडशीट के रूप में सहेजें। निकाले जाने वाले पैरामीटर के रूप में “सेंट्रॉइड” का चयन करें (माप का विश्लेषण > सेट करें)। उपाय क्लिक करके ROIs से “Centroid” निकालें. उत्पन्न तालिका आरओआई के निर्देशांक (एक्स, वाई) से मेल खाती है। इसे .xls स्प्रेडशीट के रूप में सहेजें। उत्तेजनाओं का जवाब देने वाली कोशिकाओं की पहचान करने के लिए कस्टम-निर्मित स्क्रिप्टनोट: MATLAB ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग यहां किया गया था, लेकिन वर्णित चरणों को किसी भी प्रोग्रामिंग भाषा में प्राप्त किया जा सकता है। उपयोगकर्ता संबंधित लेखक से अनुरोध करके हमारी कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट प्राप्त कर सकते हैं।फोटोब्लीचिंग प्रभाव सुधार: पृष्ठभूमि और फोटोब्लीचिंग प्रभाव को कम करने के लिए, प्रत्येक फटने से पहले गैर-उत्तेजक अवधि से 15-20 फ्रेम लें और उन्हें एक रैखिक वक्र [फिट (पॉली 1)] में फिट करें।नोट: इस मामले में, कुल 600-फ्रेम फिल्म के लिए जिसमें पल्स ट्रेनों के आवधिक फटने को हर 10 सेकंड में भेजा गया था, फ्रेम 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 को गैर-उत्तेजक अवधि माना जाता था। सूत्र का उपयोग करके सामान्यीकृत करें: (एक्स-मिनट) / जवाब देने वाली कोशिकाओं की पहचानसामान्यीकृत डेटा से गैर-उत्तेजक अवधियों के मूल माध्य वर्ग (आरएमएस) की गणना करें। इसे बेसलाइन सिग्नल माना जाएगा। उत्तेजक अवधि (गैर-उत्तेजक अवधि के बीच फ्रेम) की अधिकतम गणना करें। इस मामले में, कुल 600-फ्रेम फिल्म के लिए जिसमें पल्स ट्रेनों के आवधिक फटने को हर 10 सेकंड में भेजा गया था, फ्रेम 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 को उत्तेजक अवधि माना जाता था। यदि अधिकतम मान किसी विशिष्ट ROI के लिए बेसलाइन सिग्नल को 2.5 गुना से अधिक कर देता है, तो सेल को उस उत्तेजक अवधि के जवाब के रूप में टैग करें। यदि कोशिका पांच उत्तेजक अवधियों में से तीन का जवाब देती है, तो इसे एक प्रतिक्रियात्मक सेल के रूप में वर्गीकृत करें।

Representative Results

इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति इमेजिंग और विद्युत उत्तेजना Weitz एट अल.12 द्वारा आयोजित अध्ययन पर आधारित है. प्रोटोकॉल तीन मुख्य भागों के होते हैं: (1) जीसीएल के फ्लोरोसेंट लेबलिंग और विदेश मंत्रालय (चित्रा 1-बाएं) पर रेटिना के फ्लैट-बढ़ते हुए, (2) विद्युत उत्तेजना के दौरान जीसीएल में कैल्शियम गतिविधि का दृश्य (चित्रा 1-मध्य), और (3) निष्कर्षण, प्रसंस्करण, और इमेजिंग डेटा की व्याख्या(चित्रा 1-दाएं)। सबसे पहले, जैसा कि चित्रा 1-बाएं में दर्शाया गया है, लांग इवांस चूहों को इमेजिंग सत्र से पहले एएवी 2-सीएजी-जीसीएएमपी 5 जी के साथ इंट्राविट इंजेक्ट किया जाता है। इस वेक्टर के लिए इष्टतम वायरल अभिव्यक्ति इंजेक्शन12,18 के 2 से 3 सप्ताह बाद होती है। जानवर को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज करने के बाद, 30 जी सुई का उपयोग करके एक पायलट छेद बनाया जाता है, और फिर एएवी 2-सीएजी-जीसीएएमपी 5 जी के 5 माइक्रोन को धीरे-धीरे भाटा को रोकने के लिए एक सटीक सिरिंज से जुड़ी 36 जी कुंद सुई का उपयोग करके कांच में इंजेक्ट किया जाता है। वायरल अभिव्यक्ति के दौरान, सर्जरी के बाद रेटिना की स्थिति का आकलन करने के लिए एक विवो रेटिना इमेजिंग सिस्टम का उपयोग किया जाता है, जिसमें ओसीटी छवियां रेटिना परतों का विस्तृत दृश्य प्रदान करती हैं। एक बार जीन अभिव्यक्ति हासिल की है, रेटिना ध्यान से एक स्टीरियो खुर्दबीन और उच्च परिशुद्धता विच्छेदन उपकरण का उपयोग eyecup से निकाला है. इस बिंदु से, ऊतक को नमूने को संरक्षित करने के लिए ऑक्सीजन युक्त मीडिया में हेरफेर किया जाता है। जीसीएल का सामना करने के साथ उत्तेजित रेटिना, फिर स्थिरता सुनिश्चित करने और नमूना फ्लोटिंग को रोकने के लिए फ्लैट-माउंटिंग के लिए डिज़ाइन किए गए प्लेटफॉर्म पर लगाया जाता है। नमूना विदेश मंत्रालय की सतह पर लगाया जाता है जिसमें जीसीएल इलेक्ट्रोड का सामना करता है। अगला, विदेश मंत्रालय एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 1-मध्य) पर अपने इंटरफेस बोर्ड पर मुहिम शुरू की है. रेटिना नमूना एक छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर 33 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीजन युक्त मीडिया के साथ perfused है. नमूना कई घंटे के लिए इस विन्यास में बनाए रखा जा सकता है। वांछित उत्तेजना योजना क्रमादेशित है, और छवियों प्रति सेकंड 10 फ्रेम की दर से हासिल कर रहे हैं. लागू विद्युत उत्तेजना मापदंडों के अनुसार फिल्मों का नाम देने की सिफारिश की जाती है। छवि अधिग्रहण उत्तेजना के बिना कुछ आधारभूत फ्रेम प्राप्त करने के लिए उत्तेजना की दीक्षा से पहले शुरू होना चाहिए, जो एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा। अंत में, चित्रा 1-सही में सचित्र के रूप में, डेटा सेल soma खंडित द्वारा समय चूक छवियों से निकाला जाता है. डेटा को फिट करके फोटोब्लीचिंग प्रभाव को ठीक किया जाता है, और उत्तरदायी कोशिकाओं की पहचान की जाती है। उत्तरदायी कोशिकाओं को उत्तेजना के दौरान प्रतिदीप्ति चोटियों के साथ परिभाषित किया जाता है जो 2.5 गुना से अधिक उनकी आधार रेखा से अधिक है। यदि कोई कोशिका उत्तेजना के पांच फटने में से तीन का जवाब देती है, तो इसे उत्तेजना की उस विशिष्ट ट्रेन के प्रति उत्तरदायी माना जाता है। चित्रा 1: अध्ययन का अवलोकन। (बाएं) फ्लोरोसेंटली रेटिना और नमूना बढ़ते के जीसीएल लेबलिंग, (मध्य) के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण विदेश मंत्रालय द्वारा प्रदान की गई विद्युत उत्तेजना के साथ पूर्व विवो रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी की स्थापना की, और (दाएं) उत्तरदायी कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए कैल्शियम इमेजिंग डेटा का विश्लेषण किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. इंट्राविट्रियल-इंजेक्शन रेटिनाइंट्राविट्रियल इंजेक्शन से जुड़ी जटिलताओं की घटना बहुत कम है। हालांकि, कुछ जटिलताएं हैं जो इंजेक्शन घटक की परवाह किए बिना सर्जरी से ही उत्पन्न हो सकती हैं। इन जटिलताओं में मोतियाबिंद गठन, कांच का रक्तस्राव, इंट्राओकुलर दबाव की ऊंचाई और एंडोफथालमिटिस23 शामिल हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ये जटिलताएं सर्जरी के कारण होती हैं, पशु को फंडस्कोपी और ओसीटी का उपयोग करके प्रक्रिया से पहले मूल्यांकन से गुजरना पड़ता है। इंजेक्शन के तीन दिन बाद, जानवरों का पालन किया जाना चाहिए। चित्रा 2 ए-डी में, एक स्वस्थ इंजेक्शन जानवर की रेटिना दिखाया गया है। इंजेक्शन के दो सप्ताह के बाद, आरजीसी प्रतिदीप्ति है, जो प्रतिदीप्ति fundoscopy(चित्रा 2B,C)का उपयोग कर कल्पना की जा सकती व्यक्त करने के लिए शुरू. ओसीटी छवियां रेटिना परतों (चित्रा 2 डी) के स्वभाव और मोटाई का विस्तृत दृश्य प्रदान करती हैं, विशेष रूप से रेटिना डिटेचमेंट का आकलन करते समय, फंडस्कोपी की तुलना में उच्च रिज़ॉल्यूशन की पेशकश करती हैं। एक बार रेटिना फ्लैट घुड़सवार है और एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged, यह कोशिकाओं और अक्षतंतु बंडलों भेद करने के लिए संभव हो जाता है. अन्य कैल्शियम संकेतकों के विपरीत, GCaMP सूचक cytoplasm7 के लिए ही प्रतिबंधित है, और प्रतिदीप्ति नाभिक(चित्रा 2E)से बाहर रखा गया है. चित्रा 2: इंट्राविट्रियल-इंजेक्शन रेटिना की प्रतिनिधि छवियां। (ए) फंडोस्कोपी, (बी) प्रतिदीप्ति फंडोस्कोपी, (सी) प्रतिदीप्ति फंडोस्कोपी के ज़ूम-इन, (डी) ओसीटी छवि, और (ई) 500 माइक्रोन मोटी बोरोसिलिकेट ग्लास पर ग्राफीन आधारित इलेक्ट्रोड के साथ एक कस्टम विदेश मंत्रालय पर घुड़सवार एक्साइज़्ड रेटिना की एपी-प्रतिदीप्ति छवि। (ई) में, काली रेखाएं टीआई/एयू निशान के अनुरूप हैं। स्केल बार: 115 माइक्रोन (डी) और 100 माइक्रोन (ई)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. इलेक्ट्रोड और जीसीएल संपर्कतंत्रिका प्रतिक्रियाओं को प्रभावी ढंग से विकसित करने के लिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि फ्लैट-माउंटेड रेटिना विदेश मंत्रालय की सतह के निकट संपर्क में है। यह सत्यापित करने के लिए एक सरल तरीका नेत्रहीन कोशिकाओं और इलेक्ट्रोड एक ही फोकल विमान (चित्रा 3 ए) में स्थित हैं कि क्या की पुष्टि करके है. यदि कोशिकाएं इलेक्ट्रोड(चित्रा 3बी)के समान फोकल विमान में नहीं हैं, तो यह इंगित करता है कि संपर्क उप-इष्टतम है, जिसके परिणामस्वरूप कम प्रभावी उत्तेजना होगी। चित्रा 3: इलेक्ट्रोड और जीसीएल संपर्क। (ए) एक ही फोकल विमान में सेल और इलेक्ट्रोड (तारांकन)। (बी) कोशिकाओं और इलेक्ट्रोड एक ही फोकल विमान में नहीं, उस क्षेत्र में विद्युत उत्तेजना के लिए उप-इष्टतम संपर्क का संकेत देते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. एक विदेश मंत्रालय द्वारा प्रदान की गई विद्युत उत्तेजना पर पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंगकैल्शियम इमेजिंग के परिणामी डेटा में समय-चूक छवियां होती हैं जो विद्युत उत्तेजना के जवाब में सैकड़ों कोशिकाओं की तंत्रिका गतिविधि की निगरानी करती हैं। Suprathreshold उत्तेजनाओं सेल soma, प्रतिदीप्ति तीव्रता (1) में अचानक परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप, सेल soma, में एक कैल्शियम प्रवाह का कारण. यह प्रोटोकॉल यह निर्धारित करने में सक्षम बनाता है कि क्या इलेक्ट्रोड, एमईए, और / या उत्तेजना एल्गोरिथ्म तंत्रिका ऊतक में वांछित प्रतिक्रिया प्राप्त करता है। विदेश मंत्रालय पर इलेक्ट्रोड का आकार और पिच, साथ ही अध्ययन किए जा रहे ऊतक का अनुपात, चुनने के लिए उपयुक्त उद्देश्य आवर्धन निर्धारित करेगा। आमतौर पर, 5 माइक्रोन से 100 माइक्रोन तक के व्यास के साथ एकल-इलेक्ट्रोड उत्तेजना अध्ययन के लिए, एक 20-25x उद्देश्य आवर्धन उपयुक्त है (चित्रा 4 ए), लगभग 600 माइक्रोन x 600 माइक्रोन का एफओवी प्रदान करता है। कई इलेक्ट्रोड के साथ उत्तेजना से जुड़े प्रयोगों के लिए, एक 4-10x उद्देश्य बढ़ाई के आसपास 2 मिमी x 2 मिमी के व्यापक क्षेत्र का आकलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. उत्तरदायी कोशिकाओं को आसानी से समय चूक फिल्म (चित्रा 4 बी और वीडियो 1) के एक मानक विचलन छवि प्रक्षेपण उत्पन्न करके पहचाना जा सकता है. चित्रा 4: 25 माइक्रोन व्यास इलेक्ट्रोड द्वारा प्रदान की गई विद्युत उत्तेजना के साथ जीसीएल की कैल्शियम इमेजिंग। (ए) 60 एस टाइम-लैप्स फिल्म का अधिकतम प्रक्षेपण और (बी) मानक विचलन प्रक्षेपण स्पष्ट रूप से कोशिकाओं को दर्शाता है जो 25 माइक्रोन व्यास झरझरा ग्राफीन आधारित इलेक्ट्रोड से विद्युत उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं। उत्तेजक इलेक्ट्रोड एक तारांकन के साथ संकेत दिया है. स्केल बार: 50 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. नियंत्रित उत्तेजना पर समय के साथ कैल्शियम गतिशीलता का विश्लेषणप्रत्येक पहचाने गए सेल सोमा के लिए, औसत तीव्रता मान समय के साथ निकाले गए थे। चित्रा 5 ए उत्तरदायी कोशिकाओं से फोटोब्लीचिंग-सही कैल्शियम के निशान दिखाता है। इस उदाहरण में, द्विध्रुवीय पल्स ट्रेनों के पांच फटने (कैथोडिक-पहले, 40 चक्र, 1 एमएस अवधि, 2 μA आयाम) को 60 s छवि अधिग्रहण के दौरान हर 10 s (काली रेखाओं द्वारा इंगित) वितरित किया गया था। किसी दिए गए प्रयोग के भीतर, प्रतिक्रिया की स्थिरता का परीक्षण करने के लिए एक ही पांच पल्स ट्रेनों को लागू किया जाता है। गैर-उत्तेजक अवधि (लाल रंग में हाइलाइट किए गए) के दौरान कैप्चर किए गए फ्रेम का उपयोग रैखिक फिट करने के लिए किया जाता है, जो फोटोब्लीचिंग प्रभाव के लिए सही होता है। एक बार जवाब देने वाली कोशिकाओं की पहचान हो जाने के बाद, और उनके निर्देशांक (एक्स, वाई) उत्तेजक इलेक्ट्रोड के सापेक्ष जाने जाते हैं, एक कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए आवश्यक वर्तमान और उत्तेजक इलेक्ट्रोड(चित्रा 5बी)से दूरी के बीच संबंध की जांच कर सकता है। जैसा कि अपेक्षित था, उत्तेजक इलेक्ट्रोड के करीब स्थित कोशिकाओं को प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए कम वर्तमान मूल्यों की आवश्यकता होती है। चित्रा 5: विद्युत-विकसित प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व। (ए) 60 एस छवि अधिग्रहण के दौरान हर 10 एस (काली रेखाएं) पल्स ट्रेनों (द्विध्रुवीय, कैथोडिक-पहले, 40 चक्र, 1 एमएस अवधि, 2 माइक्रोन आयाम) के 5 फटने पर सेल सोमा के कैल्शियम निशान। गैर-उत्तेजक (लाल-हाइलाइट किए गए फ्रेम) और उत्तेजक अवधि (पीले-हाइलाइट किए गए फ्रेम) दिखाए जाते हैं। 2.5 गुना से आधारभूत संकेत (गैर-उत्तेजक अवधि के मूल माध्य वर्ग) को पार करने वाले निशान को विकसित प्रतिक्रियाएं माना जाता है। पांच उत्तेजक अवधियों में से तीन में प्रतिक्रिया करने वाली कोशिकाओं को प्रतिक्रिया कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। (बी) कैल्शियम गतिविधि वितरण मानचित्र उत्तेजक इलेक्ट्रोड (काले रेखांकित सर्कल) और कोशिकाओं (ग्रे रेखांकित सर्कल) दिखा रहा है। रंग कोड एक सेलुलर प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए आवश्यक न्यूनतम पल्स आयाम का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. वीडियो 1: एक 25 माइक्रोन व्यास इलेक्ट्रोड द्वारा प्रदान की विद्युत उत्तेजना के साथ जीसीएल के कैल्शियम इमेजिंग. वीडियो एक 25 माइक्रोन व्यास झरझरा ग्राफीन आधारित इलेक्ट्रोड से विद्युत उत्तेजना के कारण प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर प्रदर्शित करता है. बाईं ओर मूल फिल्म दिखाता है, और दाईं ओर मानक विचलन प्रक्षेपण दिखाता है जहां प्रतिक्रिया कोशिकाओं को आसानी से पहचाना जा सकता है। स्केल बार: 50 माइक्रोन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक विदेश मंत्रालय के साथ प्रदान की विद्युत उत्तेजना पर चूहे रेटिना जीसीएल में होने वाली कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए कार्य करता है. यह एक विश्वसनीय और प्रबंधनीय विधि है, लेकिन कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता है, विशेष रूप से समान रूप से जीसीएल को कुशलतापूर्वक लेबल करने और इष्टतम ऊतक-इलेक्ट्रोड संपर्क सुनिश्चित करने के लिए रेटिना को ठीक से माउंट करने के लिए। यह प्रोटोकॉल कृन्तकों के लिए विशिष्ट है और यदि एक अलग प्रयोगशाला प्रजातियों पर लागू किया जाता है तो इसे अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। कार्यप्रणाली के महत्वपूर्ण बिंदुओं, संशोधनों और सीमाओं को विस्तार से प्रस्तुत किया गया है।

इंट्राविट्रियल इंजेक्शन
इंजेक्शन का व्यापक रूप से ओकुलर जीन डिलीवरी के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें इंट्राविट्रियल इंजेक्शन पसंदीदा प्रक्रिया है। वे सुरक्षित और subretinal इंजेक्शन, जो फोटोरिसेप्टर और रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) के बीच सीधे ब्याज के अणुओं का परिचय, रेटिना टुकड़ी¹⁰ जोखिम की तुलना में साबित हुए हैं. हालांकि, सीमाएं हैं, खासकर जब कृंतक मॉडल में इन इंजेक्शन का प्रदर्शन करते हैं। कांच का हास्य जिलेटिनस है, वायरल प्रसार में बाधा डालता है। इसके अलावा, कृंतक आंखों में लेंस बड़ा होता है, जिससे सुई को खरोंच किए बिना डालना गैर-तुच्छ हो जाता है। सटीक सिरिंज सुई नाजुक होती है और इसे अक्सर बदलने की आवश्यकता होती है। रुकावट को रोकने के लिए, उन्हें हर उपयोग से पहले और बाद में विआयनीकृत पानी से धोएं और उन्हें नियमित रूप से बदलें। इसके अतिरिक्त, समाधान भाटा और इंट्राओकुलर दबाव में परिवर्तन को रोकने के लिए सामग्री को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें। रेटिना भर में बड़े और समान प्रतिदीप्ति को प्राप्त करने अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है.

रेटिना सेल पारगमन
वायरल वैक्टर विवो जीन वितरण में के लिए एक उत्कृष्ट विधि है, और एएवी व्यापक रूप से रेटिना कोशिकाओं¹⁰ ट्रांसड्यूसिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है. उन्हें मानव अंधापन पैदा करने वाले कुछ रेटिनोपैथी के उपचार के रूप में अनुमोदित किया गया है²⁴. हालांकि, उनकी वाहक क्षमता 5 केबी तक सीमित है, जिसमें आवश्यक नियामक तत्व (जैसे, प्रमोटर)^{10,25शामिल} हैं। कई सीरोटाइप उपलब्ध हैं, प्रत्येक अलग-अलग ट्रोपिज्म के साथ। वितरित किए जाने वाले जीन के आधार पर सबसे उपयुक्त एएवी चुनें और कोशिकाओं को²⁶ स्थानांतरित किया जाना चाहिए। RGC लेबलिंग के लिए, AAV2²⁷ का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।

जीन अभिव्यक्ति खिड़की
AAV2-CAG-GCaMP5G के लिए इष्टतम वायरल अभिव्यक्ति इंजेक्शन 2 के बाद 3 से ^12,18 सप्ताह है। उस समय सीमा से परे, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से नाभिक फ्लोरोसेंट बन जाते हैं, कोशिकाएं उत्तेजनाओं का जवाब देना बंद कर देती हैं, और अंततः ^7,28,29 मर जाती हैं। यह GCaMP संकेतक की अतिअभिव्यक्ति के कारण है, जिसे नाभिक में स्थानांतरित किया जाता है। इष्टतम जीन अभिव्यक्ति के लिए समय खिड़की वायरल वेक्टर और चुना प्रमोटर³⁰ के आधार पर अलग अलग होंगे और इस प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए.

ऊतक-इलेक्ट्रोड संपर्क
इष्टतम और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए, अच्छा ऊतक-इलेक्ट्रोड संपर्क प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। खराब संपर्क आमतौर पर रेटिना की प्राकृतिक वक्रता के कारण होता है। एक दृष्टिकोण यह है कि रेटिना को क्वार्टर में काटें, एक समय में एक खंड को माउंट और छवि दें। रेटिना के छोटे हिस्से को बेहतर ढंग से चपटा किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप विदेश मंत्रालय की सतह के साथ अधिक प्रभावी संपर्क होता है। खराब संपर्क का एक अन्य संभावित कारण कांच के हास्य की उपस्थिति है। जब उत्तेजना प्रयोगों का आयोजन एक epi-रेटिना प्रत्यारोपण अनुकरण, यह ध्यान से रेटिना छांटना के दौरान कांच हास्य को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह वर्तमान करने के लिए एक इन्सुलेटर के रूप में कार्य कर सकते हैं. यहां, एक ही फोकल विमान में इलेक्ट्रोड और कोशिकाओं की कल्पना करके संपर्क पर्याप्त है या नहीं, यह जांचने के लिए एक सरल विधि का वर्णन किया गया है।

पूर्व विवो रेटिना माप का एक विकल्प इलेक्ट्रोड की सतह पर सीधे न्यूरॉन्स विकसित करना है। न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति, जैसे हिप्पोकैम्पस^{न्यूरॉन्स 31}, उपन्यास उत्तेजक डिवाइस की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए प्रारंभिक परीक्षणों के लिए उपयोगी हो सकती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण को अभी भी प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग की आवश्यकता है और रेटिना नेटवर्क की जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, जो उत्तेजना के लिए सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है।

इलेक्ट्रोड और इलेक्ट्रोड निशान के नीचे कोशिकाओं कल्पना करने के लिए, ऐसे इंडियम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) के रूप में पारदर्शी सामग्री के साथ निर्मित विदेश मंत्रालय 19,20,32इस्तेमाल किया जा सकता है. ऑप्टिकल माप के अलावा, विद्युत उत्तेजना पर जीसीएल गतिविधि का मूल्यांकन विद्युत रिकॉर्डिंग के माध्यम से किया जा सकता है। विदेश मंत्रालय का उपयोग ऊतक की स्थानीय क्षेत्र क्षमता (LFP) को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह स्थानिक संकल्प से समझौता करता है, क्योंकि प्रत्येक इलेक्ट्रोड एक साथ कई कोशिकाओं से गतिविधि को कैप्चर करता है (इलेक्ट्रोड आयामों के आधार पर)। ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग इस सीमा को पार करती है और उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन मैपिंग प्रदान करती है। इसका मुख्य लाभ एकल-कोशिका संकल्प के साथ एक बड़े एफओवी को मापने के दौरान सक्रिय और निष्क्रिय कोशिकाओं के बीच अंतर करने की क्षमता है। सभी सेलुलर गतिविधि संवाददाताओं के बीच, कैल्शियम संकेतक अच्छी तरह से वर्णित हैं और सबसे अधिक³³ का उपयोग किया जाता है।

Materials

20x NA 0.75 S Fluor air objective	Nikon	CFI Super Fluor 20X	–
3.5 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-90	–
30 G needle	VWR	613-5373	–
36 G blunt needle	World Precision Instruments	NF36BL-2	–
6 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-94	–
AAV2-CAG-GCaMP5G	Vector Biolabs	–	–
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420	–
Blade	Swann-morton	0308	–
Camera	Hamamatsu	ORCA Flash v4.0	–
Carbogen	Air liquide	–	–
Curved-forceps	–	–	–
Fine spring-scissors	FST	91501-09	–
FITC filter cube	Nikon	Standard series	–
Fluorescent lamp	Nikon	C-HGFI	–
Fluorescent stereomicroscope	Nikon	SMZ25	–
HBSS	Capricorn	HBSS-1A	–
ImageJ/FIJI	NIH	v1.50i	–
In vivo retinal imaging system	Phoenix Research Laboratories	Micron III	–
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti	–
Isofluorane	Arrane Baxter Laboratories	–	–
Long-Evans rat	Janvier	–	–
MATLAB (Version R2021b)	Mathworks	–	–
Media filters	Merckmillipore	SCGPS02RE	–
Methocel 2%	Omni Vision	–	–
Microelectrode array (MEA)	–	Custom-made
NaHCO3	Thermofisher	42427	–
Penicillin/Streptomycin 100x	Thermofisher	15140122	–
Phenylephrine	Alcon Cusí Laboratories	653437.3	100 mg/mL
Plastic pipette	VWR	612-1793	–
Porous membrane	Merckmillipore	#JVWP01300	–
Precision syringe	World Precision Instruments	10 µl Nanofil	–
Prescaina	Llorens	–	Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic
Rat nasal mask	Xenotec	XRK-RA	–
Small curved-forceps	Bbraun	AESCBD311R	–
Spring-scissors	FST	15040-11	–
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000	–
Straight forceps	FST	11252-20	–
Suture filament	Vitrex Medical	4328	Nilon monofilament, 7/0, DS12
Tobradex	Alcon Cusí Laboratories	–	Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL)
Tropicamide	Alcon Cusí Laboratories	653486	10 mg/mL
Washer	Thorlabs	W8S038	–