Um procedimento para extrair DNA livre de células do humor vítreo e aquoso para realizar estudos moleculares para o diagnóstico de linfoma vitreorretiniano é estabelecido aqui. O método oferece a capacidade de extrair simultaneamente o DNA do componente celular da amostra ou reservá-lo para testes auxiliares.
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Artigo de método
Extração de DNA livre de células de espécimes de humor vítreo e aquoso para diagnóstico e monitoramento de linfoma vitreorretiniano
Neste artigo
Resumo
Resumo
O linfoma vitreorretiniano (LVV) representa um linfoma agressivo, frequentemente categorizado como linfoma primário de grandes células B difuso do sistema nervoso central. Para o diagnóstico da LVR, são coletados espécimes como humor vítreo e, mais recentemente, humor aquoso. Os testes diagnósticos para VRL nesses espécimes incluem citologia, citometria de fluxo e teste molecular. No entanto, tanto a citopatologia quanto a citometria de fluxo, juntamente com o teste molecular usando DNA celular, necessitam de células inteiras intactas. O desafio está no fato de que o humor vítreo e aquoso normalmente tem baixa celularidade, e muitas células são destruídas durante a coleta, armazenamento e processamento. Além disso, esses espécimes apresentam dificuldades adicionais para testes moleculares devido à alta viscosidade do humor vítreo e ao baixo volume do humor vítreo e aquoso. Este estudo propõe um método para extração de DNA livre de células de espécimes vítreos e aquosos. Essa abordagem complementa a extração de DNA celular ou permite que o componente celular desses espécimes seja utilizado para outros métodos diagnósticos, incluindo citologia e citometria de fluxo.
Introdução
O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo associado ao linfoma difuso primário de grandes células B do sistema nervoso central1,2,3. A VRL é tipicamente fatal devido ao seu envolvimento no sistema nervoso central 1,2. Embora rara1,4, a VRL frequentemente apresenta sintomas semelhantes à uveíte posterior e outras doenças vitreorretinianas4,5. Consequentemente, os pacientes que apresentam s....
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Protocolo
O presente protocolo segue as diretrizes de cuidados humanos e com aprovação do comitê de revisão institucional (IRB) da Universidade de Michigan. Para tal, obteve-se a dispensa do termo de consentimento livre e esclarecido junto ao CEP. Não há critérios relevantes de inclusão ou exclusão para os pacientes envolvidos.
1. Separação de componentes celulares e livres de células
NOTA: Três tipos de amostras podem ser recebidas para testes diagnósticos de VRL: vítreo (não diluído; líquido de vitrectomia coletado antes do início da infusão), vítreo diluído dentro de uma bolsa de fita (
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Resultados
Esses métodos de extração foram realizados em um número limitado de casos para garantir o rendimento adequado e a amplificabilidade do DNA livre de células em comparação com o DNA celular dos espécimes vítreos (quatro) e aquosos (quatro). A partir dessas amostras, os rendimentos de DNA do componente livre de células desses fluidos são semelhantes aos do componente celular (Tabela 1). O DNA celular e o cfDNA dessas amostras também foram avaliados por meio de testes moleculares, como para a mutação associa.......
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Discussão
O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo de grandes células B 1,2,3 cujos sintomas podem mimetizar outras doenças vitreorretinianas4,5. O teste molecular do humor vítreo e, mais recentemente, aquoso tornou-se um método crítico para fazer o diagnóstico de VRL ou descartá-lo. No entanto, esses fluidos são muito baixos em volume e muitas vezes têm baixa celul.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, e Helmut Weigelin, MLS(ASCP) foram fundamentais para estabelecer este método de extração em nosso laboratório.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrador-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrador-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein | Precipitation Solution Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Kit de Urina | Zymo Research | D3061 | Tampão de condicionamento; também inclui esferas de limpeza, Proteinase K e colunas de spin |
| Glicogênio Ultrapuro, 20 µ g/µ L (20 mg/ml) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
Referências
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
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Reimpressões e permissões
