缝合扩张小鼠模型中骨重塑的 3D 可视化技术
Summary
该协议提出了一个标准化的缝合扩张小鼠模型和3-D可视化方法，以研究拉伸力载荷下缝合线和骨重塑的机械生物学变化。
Abstract
颅面缝合线除了是连接颅面骨的纤维关节外，还起着至关重要的作用;它们也是颅骨和面部骨骼生长的主要生态位，容纳间充质干细胞和骨祖细胞。由于大多数颅面骨是通过膜内骨化发育的，因此缝合线的边缘区域充当起始点。由于这一重要性，这些缝合线已成为骨科治疗中有趣的靶标，如弹簧辅助颅穹窿扩张、上颌骨快速扩张和上颌骨牵伸。在骨科示踪力的作用下，缝合干细胞被迅速激活，成为扩增过程中骨重塑的动态来源。尽管它们很重要，但骨重塑期间的生理变化仍然知之甚少。传统的切片方法，主要是矢状方向，无法捕捉到整个缝合线中发生的全面变化。本研究建立了矢状缝扩张的标准小鼠模型。为了充分可视化缝合扩张后的骨重塑变化，PEGASOS组织清除方法与全安装EdU染色和钙螯合双标记相结合。这使得在扩张后在整个颅骨上看到高度增殖的细胞和新的骨形成。该协议提供了标准化的缝合扩张小鼠模型和3D可视化方法，揭示了拉伸力载荷下缝合和骨重塑的机械生物学变化。
Introduction
颅面缝合线是连接颅面骨的纤维组织，在颅面骨的生长和重塑中起着至关重要的作用。缝合线的结构类似于河流，提供细胞资源流来滋养和构建“河岸”，称为成骨前沿，通过膜内成骨促进颅面骨的形成1。
对颅面缝合线的兴趣是由临床需求驱动的，即了解颅缝过早闭合和面部缝合功能障碍，这可能导致颅面畸形，甚至危及儿童生命的疾病。开放缝合切除术是临床治疗的常规应用，但长期随访显示一些患者再骨化复发不完全2.微创开颅手术由扩张弹簧或内窥镜条纹颅骨切除术辅助，可能提供一种更安全的方法来保留潜在的缝合线，而不是丢弃组织3.同样，面罩和扩张器具等骨科疗法已被广泛用于治疗矢状或水平上颌骨发育不全，一些研究将年龄限制扩大到通过微型螺钉辅助腭扩张器治疗成年患者 4,5,6。此外，间充质干细胞 （MSCs） 结合可生物降解材料的颅缝再生是未来的潜在疗法，为相关疾病的治疗提供了新的方向7.然而，缝合线的功能过程或调节机制仍然难以捉摸。
骨重塑主要由成骨细胞进行的骨形成和破骨细胞进行的骨吸收之间的平衡组成，其中机械信号刺激的干细胞成骨分化起着重要作用。经过几十年的研究，人们发现颅面缝合线是高度可塑的间充质干细胞生态位8。缝合干细胞（SuSCs）是一组异质性干细胞，属于间充质干细胞（MSCs）或骨干细胞（SSCs）。SuSCs 在体内 由Gli1、Axin2、Prrx1和Ctsk等4个标记物标记，特别是Gli1+ SuSCs，严格验证了干细胞的生物学特性，不仅表现出典型MSC标志物的高表达，而且表现出优异的成骨和软骨生成潜力9。先前的研究表明，Gli1+ SuSCs 在拉伸力下积极促进新骨形成，将它们确定为支持牵引成骨的缝合干细胞来源10。
过去，通过Flexcell、四点弯曲、微磁体加载系统等在体外研究了干细胞的广泛机械特性。尽管在体外11中已经鉴定出小鼠颅骨缝合来源的间充质细胞，并且最近也分离出人类缝合间充质干细胞12，但缝合细胞的生物力学反应在体外系统中仍不清楚。为了进一步研究骨重塑过程，建立了基于分离颅骨器官培养的缝合扩张模型，为建立有用的体内缝合扩张模型铺平了道路 1,13。兔14 和大鼠15 是缝合扩张基础研究中应用最广泛的动物。然而，小鼠因其与人类高度同源的基因组、众多的基因修饰系和较强的生殖杂交能力，是探索人类疾病的首选动物模型。现有的颅骨缝合扩张小鼠模型通常依靠不锈钢正畸弹簧线对矢状缝线施加拉伸力16,17。在这些模型中，在顶骨的每一侧各打两个孔来固定扩张装置，并将导线嵌入皮肤下，这可能会影响细胞活化模式。
在可视化方法方面，切片在矢状方向上的二维观察已经普遍采用数十年。然而，考虑到骨重塑是一个复杂的三维动态过程，获取完整的三维信息已成为当务之急。PEGASOS组织透明技术的出现是为了满足这一要求18,19。它为硬组织和软组织的透明度提供了独特的优势，使完整的骨重塑过程能够在三维空间中再现。
为了更深入、更全面地了解骨重塑期的生理变化，建立了一个标准的矢状缝合扩张小鼠模型，在手工制作的支架之间设置了弹簧设置10。通过标准化的酸蚀刻和粘合程序，膨胀装置可以牢固地粘合到颅骨上，产生垂直于矢状缝的拉力。此外，在矿化骨扩张后双标记后应用PEGASOS组织清除方法，以充分可视化缝合扩张后的骨骼建模变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们应用了标准的缝合扩张小鼠模型来观察在整个为期一个月的重塑周期10 中每周发生的规律形态变化。该模型可用于通过扩大颅骨缝合线来研究颅骨重塑和再生，以及研究体内各种缝合细胞。为了充分展示此类研究的结果，需要对染色组织进行三维可视化。因此，PEGASOS技术以其清除硬组织的效率而闻名19,20，与双重标记和EdU?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢上海交通大学医学院耳科研究所的实验室平台和协助。这项工作得到了上海浦江项目（22PJ1409200）的支持;国家自然科学基金（No.11932012）;上海交通大学医学院附属第九人民医院博士后科研基金;上海交通大学医学院附属第九人民医院基础研究项目资助（JYZZ154）。
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
Referências
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