Denne protokol præsenterer en standardiseret suturudvidelsesmusemodel og en 3D-visualiseringsmetode til at studere de mekanobiologiske ændringer af sutur og knoglemodellering under trækkraftbelastning.
Kraniofaciale suturer spiller en afgørende rolle ud over at være fibrøse led, der forbinder kraniofaciale knogler; De tjener også som den primære niche for calvarial og facial knoglevækst, der huser mesenkymale stamceller og osteoprogenitorer. Da de fleste kraniofaciale knogler udvikler sig gennem intramembranøs ossifikation, fungerer suturernes marginale regioner som initieringspunkter. På grund af denne betydning er disse suturer blevet spændende mål i ortopædiske terapier som fjederassisteret kraniehvelvudvidelse, hurtig maksillær ekspansion og maksillær protraktion. Under ortopædisk sporingskraft aktiveres suturstamceller hurtigt og bliver en dynamisk kilde til knoglemodellering under ekspansion. På trods af deres betydning forbliver de fysiologiske ændringer under knoglemodelleringsperioder dårligt forstået. Traditionelle sektioneringsmetoder, primært i sagittal retning, fanger ikke de omfattende ændringer, der forekommer gennem hele suturen. Denne undersøgelse etablerede en standard musemodel for sagittal suturudvidelse. For fuldt ud at visualisere knoglemodelleringsændringer efter suturudvidelse blev PEGASOS-vævsrensningsmetoden kombineret med helmonteret EdU-farvning og calciumchelaterende dobbeltmærkning. Dette muliggjorde visualisering af stærkt prolifererende celler og ny knogledannelse på tværs af hele calvariale knogler efter ekspansion. Denne protokol tilbyder en standardiseret suturudvidelsesmusemodel og en 3D-visualiseringsmetode, der kaster lys over de mekanobiologiske ændringer i suturer og knoglemodellering under trækkraftbelastning.
Kraniofacial suturer er fibrøst væv, der forbinder kraniofaciale knogler og spiller vigtige roller i vækst og ombygning af kraniofaciale knogler. Suturens struktur ligner en flod, der giver en strøm af celleressourcer til at nære og opbygge “flodbredden”, kendt som de osteogene fronter, som bidrager til dannelsen af kraniofaciale knogler via intramembranøs osteogenese1.
Interessen for kraniofaciale suturer har været drevet af kliniske behov for at forstå for tidlig lukning af kraniesuturer og ansigtssuturdysfunktion, hvilket kan føre til kraniofaciale deformiteter og endda livstruende tilstande hos børn. Åben suturektomi anvendes rutinemæssigt i klinisk behandling, men langvarig opfølgning har vist ufuldstændig re-ossifikation tilbagefald hos nogle patienter2. Minimalt invasiv kraniotomi assisteret af ekspansionsfjedre eller endoskopisk stribe kraniektomi kan give en sikrere tilgang til at bevare den potentielle sutur snarere end at kassere vævene3. Tilsvarende har ortopædiske terapier såsom ansigtsmasker og ekspansionsapparater været meget udbredt til behandling af sagittal eller vandret maksillær hypoplasi, hvor nogle undersøgelser udvider aldersbegrænsningen til behandling af voksne patienter via miniscrew-assisterede palatale ekspandere 4,5,6. Derudover er kranial suturregenerering med mesenkymale stamceller (MSC’er) kombineret med biologisk nedbrydelige materialer en potentiel terapi i fremtiden, der tilbyder en ny retning for behandling af relaterede sygdomme7. Imidlertid forbliver funktionsprocessen eller reguleringsmekanismen for suturer undvigende.
Knoglemodellering består hovedsageligt af en balance mellem knogledannelse udført af osteoblaster og knogleresorption udført af osteoklaster, hvor osteogen differentiering af stamceller stimuleret af mekaniske signaler spiller en vigtig rolle. Efter årtiers forskning har det vist sig, at kraniofaciale suturer er meget plastiske mesenkymale stamcellenicher8. Suturstamceller (SuSC’er) er en heterogen gruppe af stamceller, der tilhører mesenkymale stamceller (MSC’er) eller knoglestamceller (SSC’er). SuSC’er er mærket in vivo med fire markører, herunder Gli1, Axin2, Prrx1 og Ctsk. Især Gli1+ SuSC’er har nøje verificeret stamcellernes biologiske egenskaber og udviser ikke kun høj ekspression af typiske MSC-markører, men viser også fremragende osteogent og kondrogent potentiale9. Tidligere forskning har vist, at Gli1+ SuSC’er aktivt bidrager til ny knogledannelse under trækkraft og identificerer dem som suturstamcellekilden, der understøtter distraktionsosteogenese10.
Tidligere blev omfattende mekaniske egenskaber ved stamceller undersøgt in vitro via Flexcell, firepunktsbøjning, mikromagnetbelastningssystem og andre. Selvom mesenkymale celler afledt af mus er blevet identificeret in vitro11, og humane suturmesenkymale stamceller også er blevet isoleret for nylig12, forbliver suturcellernes biomekaniske respons uklar i in vitro-systemet. For yderligere at undersøge knoglemodelleringsprocessen er der etableret en suturudvidelsesmodel baseret på isoleret calvaria-organkultur, hvilket baner vejen for etablering af en nyttig de vivo-suturudvidelsesmodel 1,13. Kaniner14 og rotter15 har været de mest anvendte dyr i grundforskning til suturudvidelse. Imidlertid er mus foretrukne dyremodeller til at udforske menneskelig sygdom på grund af deres meget homologe genom med mennesker, adskillige genmodifikationslinjer og stærk reproduktiv hybridiseringsevne. Eksisterende musemodeller af kranial suturudvidelse er typisk afhængige af ortodontiske fjedertråde i rustfrit stål for at påføre trækkraft på sagittalsuturen 16,17. I disse modeller er der lavet to huller i hver side af parietalbenene for at fastgøre ekspansionsanordningen, og ledningerne er indlejret under huden, hvilket kan påvirke celleaktiveringstilstanden.
Med hensyn til visualiseringsmetoden er den todimensionelle observation af skiver i sagittal retning generelt blevet vedtaget i årtier. I betragtning af at knoglemodellering er en kompleks tredimensionel dynamisk proces, er opnåelse af komplet tredimensionel information imidlertid blevet et presserende behov. PEGASOS-vævsgennemsigtighedsteknikken opfyldte dette krav18,19. Det giver unikke fordele for gennemsigtigheden af hårdt og blødt væv, hvilket gør det muligt at reproducere den komplette knoglemodelleringsproces i tredimensionelt rum.
For at få en dybere og mere omfattende forståelse af de fysiologiske ændringer i knogleremodelleringsperioderne blev der etableret en standard sagittal suturudvidelsesmusemodel med en fjederindstilling mellem de håndlavede holdere10. Med en standardiseret syreætsnings- og bindingsprocedure kunne ekspansionsanordningen være fast bundet til kraniebenet og generere en trækkraft vinkelret på sagittalsuturen. Desuden blev PEGASOS-vævsrensningsmetoden anvendt efter dobbeltmærkning af den mineraliserede knogle efter ekspansion for fuldt ud at visualisere knoglemodelleringsændringerne efter suturudvidelse.
Vi anvendte en standard suturudvidelsesmusemodel til at observere de regelmæssige morfologiske ændringer, der opstår hver uge i hele den månedlange ombygningscyklus10. Denne model er nyttig til forskning i calvarial knoglemodellering og regenerering ved at udvide calvariale suturer samt til at studere forskellige suturceller in vivo. For fuldt ud at præsentere resultaterne af sådan forskning er der behov for tredimensionel visualisering af farvede væv. Derfor blev PEGASOS-teknologi…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker for laboratorieplatformen og hjælp fra Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Dette arbejde blev støttet af Shanghai Pujiang-programmet (22PJ1409200); Kinas nationale naturvidenskabelige fond (nr. 11932012); Postdoktoral videnskabelig forskning Foundation af Shanghai niende folks hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Finansiering af grundforskningsprogram af Ninth People’s Hospital tilknyttet Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).
37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
EdU | Invitrogen | E104152 | |
Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |