Technique de visualisation 3D pour le remodelage osseux dans un modèle murin d’expansion de suture
Summary
Ce protocole présente un modèle murin standardisé d’expansion de suture et une méthode de visualisation 3D pour étudier les changements mécanobiologiques de la suture et le remodelage osseux sous charge de force de traction.
Abstract
Les sutures craniofaciales jouent un rôle crucial au-delà d’être des articulations fibreuses reliant les os craniofaciaux ; Ils servent également de niche principale pour la croissance des os calvaires et faciaux, abritant des cellules souches mésenchymateuses et des ostéoprogéniteurs. Comme la plupart des os cranio-faciaux se développent par ossification intramembraneuse, les régions marginales des sutures agissent comme des points d’initiation. En raison de cette importance, ces sutures sont devenues des cibles intrigantes dans les thérapies orthopédiques telles que l’expansion de la voûte crânienne assistée par ressort, l’expansion maxillaire rapide et la traction maxillaire. Sous l’effet de la force de traçage orthopédique, les cellules souches de suture sont rapidement activées, devenant une source dynamique de remodelage osseux pendant l’expansion. Malgré leur importance, les changements physiologiques au cours des périodes de remodelage osseux restent mal compris. Les méthodes de coupe traditionnelles, principalement dans le sens sagittal, ne capturent pas les changements globaux qui se produisent dans l’ensemble de la suture. Cette étude a permis d’établir un modèle murin standard pour l’expansion de la suture sagittale. Pour visualiser pleinement les changements de remodelage osseux après l’expansion de la suture, la méthode d’élimination des tissus PEGASOS a été combinée avec une coloration EdU à montage complet et un double marquage chélateur du calcium. Cela a permis de visualiser des cellules hautement proliférantes et la formation de nouveaux os sur l’ensemble des os calvaires après l’expansion. Ce protocole offre un modèle murin standardisé d’expansion de suture et une méthode de visualisation 3D, mettant en lumière les changements mécanobiologiques dans les sutures et le remodelage osseux sous charge de force de traction.
Introduction
Les sutures craniofaciales sont des tissus fibreux qui relient les os craniofaciaux et jouent un rôle essentiel dans la croissance et le remodelage des os craniofaciaux. La structure de la suture ressemble à une rivière, fournissant un flux de ressources cellulaires pour nourrir et construire la « berge de la rivière », connue sous le nom de fronts ostéogéniques, qui contribuent à la formation des os craniofaciaux via l’ostéogenèse intramembraneuse1.
L’intérêt pour les sutures craniofaciales a été motivé par les besoins cliniques de comprendre la fermeture prématurée des sutures crâniennes et le dysfonctionnement des sutures faciales, qui peuvent entraîner des déformations craniofaciales et même des conditions potentiellement mortelles chez les enfants. La suturectomie ouverte est couramment utilisée dans le traitement clinique, mais un suivi à long terme a montré une récidive de réossification incomplète chez certains patients2. La craniotomie mini-invasive assistée par ressorts d’expansion ou la craniectomie endoscopique peut constituer une approche plus sûre pour préserver la suture potentielle plutôt que de jeter les tissus3. De même, les thérapies orthopédiques telles que les masques faciaux et les appareils d’expansion ont été largement utilisées pour traiter l’hypoplasie sagittale ou maxillaire horizontale, certaines études étendant la limite d’âge pour traiter les patients adultes via des expanseurs palatins assistés par minivis 4,5,6. De plus, la régénération des sutures crâniennes avec des cellules souches mésenchymateuses (CSM) combinées à des matériaux biodégradables est une thérapie potentielle à l’avenir, offrant une nouvelle direction pour le traitement des maladies connexes7. Cependant, le processus de fonction ou le mécanisme de régulation des sutures reste insaisissable.
Le remodelage osseux consiste principalement en un équilibre entre la formation osseuse menée par les ostéoblastes et la résorption osseuse effectuée par les ostéoclastes, où la différenciation ostéogénique des cellules souches stimulée par des signaux mécaniques joue un rôle important. Après des décennies de recherche, il a été constaté que les sutures craniofaciales sont des niches de cellules souches mésenchymateuses hautement plastiques8. Les cellules souches de suture (SuSC) sont un groupe hétérogène de cellules souches, appartenant aux cellules souches mésenchymateuses (CSM) ou aux cellules souches osseuses (CSS). Les SuSCs sont marqués in vivo par quatre marqueurs, dont Gli1, Axin2, Prrx1 et Ctsk. Les SuSCs Gli1+ , en particulier, ont strictement vérifié les caractéristiques biologiques des cellules souches, non seulement en présentant une forte expression des marqueurs MSC typiques, mais aussi en démontrant un excellent potentiel ostéogénique et chondrogénique9. Des recherches antérieures ont montré que les SuSC Gli1+ contribuent activement à la formation de nouveaux os sous l’effet de la force de traction, les identifiant comme la source de cellules souches de suture soutenant l’ostéogenèse de distraction10.
Dans le passé, les caractéristiques mécaniques étendues des cellules souches ont été étudiées in vitro via Flexcell, la courbure en quatre points, le système de chargement par micro-aimant, etc. Bien que des cellules mésenchymateuses dérivées de sutures crâniennes de souris aient été identifiées in vitro11 et que des cellules souches mésenchymateuses de suture humaine aient également été isolées récemment12, la réponse biomécanique des cellules de suture reste incertaine dans le système in vitro. Pour étudier plus en détail le processus de remodelage osseux, un modèle d’expansion de suture basé sur la culture d’organes de calvaria isolés a été établi, ouvrant la voie à l’établissement d’un modèle d’expansion de suture in vivo utile 1,13. Les lapins14 et les rats15 ont été les animaux les plus utilisés dans la recherche fondamentale pour l’expansion des sutures. Cependant, les souris sont des modèles animaux préférés pour explorer les maladies humaines en raison de leur génome hautement homologue avec celui des humains, de leurs nombreuses lignées de modification génétique et de leur forte capacité d’hybridation reproductive. Les modèles murins existants d’expansion de la suture crânienne reposent généralement sur des fils à ressort orthodontiques en acier inoxydable pour appliquer une force de traction à la suture sagittale16,17. Dans ces modèles, deux trous sont percés de chaque côté des os pariétaux pour fixer le dispositif d’expansion, et les fils sont intégrés sous la peau, ce qui peut affecter le mode d’activation cellulaire.
En ce qui concerne la méthode de visualisation, l’observation bidimensionnelle des tranches dans la direction sagittale est généralement adoptée depuis des décennies. Cependant, étant donné que le remodelage osseux est un processus dynamique tridimensionnel complexe, l’obtention d’informations tridimensionnelles complètes est devenue un besoin urgent. C’est pour répondre à cette exigence que la technique de transparence tissulaire PEGASOS a vu le jour18,19. Il offre des avantages uniques pour la transparence des tissus durs et mous, permettant de reproduire l’ensemble du processus de remodelage osseux dans un espace tridimensionnel.
Pour acquérir une compréhension plus profonde et plus complète des changements physiologiques dans les périodes de remodelage osseux, un modèle de souris standard d’expansion de suture sagittale avec un réglage à ressort entre les supports faits à la main a été établi10. Grâce à une procédure normalisée de gravure et de collage à l’acide, le dispositif d’expansion pourrait être fermement lié à l’os crânien, générant une force de traction perpendiculaire à la suture sagittale. De plus, la méthode d’élimination des tissus PEGASOS a été appliquée après le double marquage de l’os minéralisé après l’expansion afin de visualiser pleinement les changements de modélisation osseuse après l’expansion de la suture.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons appliqué un modèle murin standard d’expansion de suture pour observer les changements morphologiques réguliers qui se produisent chaque semaine pendant tout le cycle de remodelage d’un mois10. Ce modèle est utile pour la recherche sur le remodelage et la régénération de l’os calvaire par l’expansion des sutures calvaires, ainsi que pour l’étude de diverses cellules de suture in vivo. Pour présenter pleinement les résultats de ces recherches, une visualisatio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions pour la plate-forme de laboratoire et l’assistance de l’Institut de l’oreille de l’École de médecine de l’Université Jiaotong de Shanghai. Ce travail a été soutenu par le programme Pujiang de Shanghai (22PJ1409200) ; Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 11932012) ; Fondation de recherche scientifique postdoctorale de l’Hôpital du neuvième peuple de Shanghai, École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai ; Financement du programme de recherche fondamentale du Neuvième Hôpital du Peuple affilié à la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (JYZZ154).
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
Referências
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