एक सिवनी विस्तार माउस मॉडल में हड्डी रीमॉडेलिंग के लिए एक 3-डी दृश्य तकनीक
Summary
यह प्रोटोकॉल तन्यता बल लोडिंग के तहत सिवनी और हड्डी रीमॉडेलिंग के मेकेनोबायोलॉजिकल परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक मानकीकृत सिवनी विस्तार माउस मॉडल और एक 3-डी विज़ुअलाइज़ेशन विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
क्रानियोफेशियल टांके क्रानियोफेशियल हड्डियों को जोड़ने वाले रेशेदार जोड़ों से परे एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; वे कैल्वरियल और चेहरे की हड्डी के विकास के लिए प्राथमिक स्थान के रूप में भी काम करते हैं, आवास मेसेनकाइमल स्टेम सेल और ऑस्टियोप्रोजेनिटर्स हैं। चूंकि अधिकांश क्रानियोफेशियल हड्डियां इंट्रामेम्ब्रानस ऑसिफिकेशन के माध्यम से विकसित होती हैं, टांके के सीमांत क्षेत्र दीक्षा बिंदुओं के रूप में कार्य करते हैं। इस महत्व के कारण, ये टांके आर्थोपेडिक उपचारों में पेचीदा लक्ष्य बन गए हैं जैसे वसंत-सहायता प्राप्त कपाल तिजोरी विस्तार, तेजी से मैक्सिलरी विस्तार और मैक्सिलरी प्रोट्रैक्शन। आर्थोपेडिक ट्रेसिंग बल के तहत, सिवनी स्टेम सेल तेजी से सक्रिय होते हैं, विस्तार के दौरान हड्डी रीमॉडेलिंग के लिए एक गतिशील स्रोत बन जाते हैं। उनके महत्व के बावजूद, हड्डी रीमॉडेलिंग अवधि के दौरान शारीरिक परिवर्तन खराब समझ में आते हैं। पारंपरिक सेक्शनिंग विधियों, मुख्य रूप से धनु दिशा में, पूरे सिवनी में होने वाले व्यापक परिवर्तनों पर कब्जा नहीं करते हैं। इस अध्ययन ने बाण के समान सिवनी विस्तार के लिए एक मानक माउस मॉडल स्थापित किया। सिवनी विस्तार के बाद हड्डी रीमॉडेलिंग परिवर्तनों की पूरी तरह से कल्पना करने के लिए, पेगासोस ऊतक समाशोधन विधि को पूरे-माउंट ईडीयू धुंधला और कैल्शियम चेलेटिंग डबल लेबलिंग के साथ जोड़ा गया था। इसने विस्तार के बाद पूरे कैल्वरियल हड्डियों में अत्यधिक प्रसार कोशिकाओं और नई हड्डी के गठन के दृश्य की अनुमति दी। यह प्रोटोकॉल एक मानकीकृत सिवनी विस्तार माउस मॉडल और एक 3-डी विज़ुअलाइज़ेशन विधि प्रदान करता है, जो तन्य बल लोडिंग के तहत टांके और हड्डी रीमॉडेलिंग में मेकेनोबायोलॉजिकल परिवर्तनों पर प्रकाश डालता है।
Introduction
क्रानियोफेशियल टांके रेशेदार ऊतक होते हैं जो क्रानियोफेशियल हड्डियों को जोड़ते हैं और क्रानियोफेशियल हड्डियों के विकास और रीमॉडेलिंग में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। सिवनी की संरचना एक नदी जैसा दिखता है, जो “नदी के किनारे” को पोषण और निर्माण करने के लिए सेल संसाधनों का प्रवाह प्रदान करता है, जिसे ओस्टोजेनिक मोर्चों के रूप में जाना जाता है, जो इंट्रामेम्ब्रानस ओस्टोजेनेसिस1 के माध्यम से क्रानियोफेशियल हड्डियों के निर्माण में योगदान देता है।
क्रानियोफेशियल टांके में रुचि को कपाल टांके और चेहरे की सिवनी शिथिलता के समय से पहले बंद होने को समझने के लिए नैदानिक आवश्यकताओं से प्रेरित किया गया है, जिससे बच्चों में क्रानियोफेशियल विकृति और यहां तक कि जीवन-धमकी की स्थिति भी हो सकती है। ओपन suturectomy नियमित रूप से नैदानिक उपचार में प्रयोग किया जाता है, लेकिन लंबे समय तक अनुवर्ती कुछ रोगियों में अपूर्ण पुन: ossification पुनरावृत्ति दिखाया गया है2. विस्तार स्प्रिंग्स या एंडोस्कोपिक पट्टी craniectomy द्वारा सहायता प्रदान न्यूनतम इनवेसिव craniotomy ऊतकों 3 त्यागने के बजाय संभावित सिवनी के संरक्षण के लिए एक सुरक्षित दृष्टिकोण प्रदान कर सकतेहैं. इसी तरह, इस तरह के चेहरे के मुखौटे और विस्तार उपकरणों के रूप में आर्थोपेडिक उपचारों का व्यापक रूप से बाण के बराबर या क्षैतिज मैक्सिलरी हाइपोप्लासिया के इलाज के लिए उपयोग किया गया है, कुछ अध्ययनों में मिनीस्क्रू-असिस्टेड पैलेटल विस्तारकों 4,5,6 के माध्यम से वयस्क रोगियों के इलाज के लिए आयु सीमा का विस्तार किया गया है। इसके साथ ही, मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के साथ कपाल सिवनी पुनर्जनन (एमएससी) biodegradable सामग्री के साथ संयुक्त भविष्य में एक संभावित चिकित्सा है,संबंधित रोगों 7 के उपचार के लिए एक उपन्यास दिशा की पेशकश. हालांकि, टांके की कार्य प्रक्रिया या नियामक तंत्र मायावी रहता है।
अस्थि रीमॉडेलिंग में मुख्य रूप से ओस्टियोब्लास्ट द्वारा आयोजित हड्डी के गठन और ओस्टियोक्लास्ट द्वारा आयोजित हड्डी के पुनर्जीवन के बीच संतुलन होता है, जहां यांत्रिक संकेतों द्वारा उत्तेजित स्टेम कोशिकाओं का ओस्टोजेनिक भेदभाव एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। दशकों के शोध के बाद, यह पाया गया है कि क्रानियोफेशियल टांके अत्यधिक प्लास्टिक मेसेनकाइमल स्टेम सेल निचे8 हैं। सिवनी स्टेम सेल (SuSCs) स्टेम सेल का एक विषम समूह है, जो मेसेनकाइमल स्टेम सेल (MSCs) या बोन स्टेम सेल (SSCs) से संबंधित है। SuSCs को चार मार्करों द्वारा विवो में लेबल किया जाता है, जिनमें Gli1, Axin2, Prrx1 और Ctsk शामिल हैं। Gli1+ SuSCs, विशेष रूप से, सख्ती से स्टेम कोशिकाओं की जैविक विशेषताओं सत्यापित किया है, न केवल ठेठ एमएससी मार्करों की उच्च अभिव्यक्ति का प्रदर्शन लेकिन यह भी उत्कृष्ट osteogenic और chondrogenic क्षमता9का प्रदर्शन. पिछले शोध से पता चला है कि Gli1 + SuSCs सक्रिय रूप से तन्य बल के तहत नई हड्डी के गठन के लिए योगदान, उन्हें सीवन स्टेम सेल स्रोत व्याकुलता osteogenesis10 का समर्थन के रूप में पहचान.
अतीत में, स्टेम कोशिकाओं की व्यापक यांत्रिक विशेषताओं फ्लेक्ससेल, चार-बिंदु झुकने, माइक्रो-चुंबक लोडिंग सिस्टम और अन्य के माध्यम से इन विट्रो में अध्ययन किया गया था। हालांकि माउस कपाल सिवनी व्युत्पन्न mesenchymal कोशिकाओं इन विट्रो11 में पहचान की गई है, और मानव सिवनी mesenchymal स्टेम कोशिकाओं को भी हाल ही में12 अलग किया गया है, सिवनी कोशिकाओं के biomechanical प्रतिक्रिया इन विट्रो प्रणाली में स्पष्ट नहीं रहता है. आगे हड्डी रीमॉडेलिंग प्रक्रिया की जांच करने के लिए, पृथक कैल्वरिया अंग संस्कृति पर आधारित एक सिवनी विस्तार मॉडल स्थापित किया गया है, जो विवो सिवनी विस्तार मॉडल 1,13 में एक उपयोगी स्थापित करने का मार्ग प्रशस्त करता है। खरगोश14 और चूहे15 सिवनी विस्तार के लिए बुनियादी अनुसंधान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले जानवर रहे हैं। हालांकि, चूहों को मनुष्यों के साथ उनके अत्यधिक समरूप जीनोम, कई जीन संशोधन लाइनों और मजबूत प्रजनन संकरण क्षमता के कारण मानव रोग की खोज के लिए पशु मॉडल पसंद किए जाते हैं। कपाल सिवनी विस्तार के मौजूदा माउस मॉडल आम तौर पर बाण के समान सिवनी16,17 के लिए तन्य बल लागू करने के लिए स्टेनलेस स्टील ऑर्थोडोंटिक वसंत तारों पर भरोसा करते हैं। इन मॉडलों में, विस्तार उपकरण को ठीक करने के लिए पार्श्विका हड्डियों के प्रत्येक तरफ दो छेद किए जाते हैं, और तारों को त्वचा के नीचे एम्बेडेड किया जाता है, जो सेल सक्रियण मोड को प्रभावित कर सकता है।
दृश्य विधि के बारे में, धनु दिशा में स्लाइस के द्वि-आयामी अवलोकन को आम तौर पर दशकों से अपनाया गया है। हालांकि, यह देखते हुए कि हड्डी रीमॉडेलिंग एक जटिल त्रि-आयामी गतिशील प्रक्रिया है, पूर्ण त्रि-आयामी जानकारी प्राप्त करना एक तत्काल आवश्यकता बन गई है। पेगासोस ऊतक पारदर्शिता तकनीक इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए उभरा, 18,19. यह कठोर और नरम ऊतकों की पारदर्शिता के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करता है, जिससे पूरी हड्डी रीमॉडेलिंग प्रक्रिया को त्रि-आयामी अंतरिक्ष में पुन: पेश किया जा सकता है।
हड्डी रीमॉडेलिंग अवधि में शारीरिक परिवर्तनों की गहरी और अधिक व्यापक समझ हासिल करने के लिए, हस्तनिर्मित धारकों के बीच एक वसंत सेटिंग के साथ एक मानक धनु सिवनी विस्तार माउस मॉडल10 स्थापित किया गया था। एक मानकीकृत एसिड नक़्क़ाशी और संबंध प्रक्रिया के साथ, विस्तार उपकरण मजबूती से कपाल हड्डी के लिए बंधुआ किया जा सकता है, बाण के बाण के लिए लंबवत एक तन्यता बल पैदा करने. इसके अलावा, पेगासोस ऊतक समाशोधन विधि को सिवनी विस्तार के बाद हड्डी मॉडलिंग परिवर्तनों को पूरी तरह से देखने के लिए खनिज हड्डी के बाद के डबल लेबलिंग के बाद लागू किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक मानक सिवनी विस्तार माउस मॉडल लागू नियमित रूप से रूपात्मक परिवर्तन है कि पूरे महीने के लंबे रीमॉडेलिंग चक्र10 के दौरान हर हफ्ते होने वाली का निरीक्षण करने के लिए. यह मॉडल कैल्वरियल टांके क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रयोगशाला मंच और कान संस्थान, शंघाई जियाओतोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन की सहायता के लिए धन्यवाद करते हैं। यह काम शंघाई पुजियांग कार्यक्रम (22PJ1409200) द्वारा समर्थित किया गया था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (No.11932012); शंघाई नौवें पीपुल्स अस्पताल के पोस्टडॉक्टोरल साइंटिफिक रिसर्च फाउंडेशन, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन; शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (JYZZ154) से संबद्ध नौवें पीपुल्स अस्पताल के मौलिक अनुसंधान कार्यक्रम का वित्त पोषण।
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
Referências
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