Una tecnica di visualizzazione 3D per il rimodellamento osseo in un modello murino di espansione della sutura
Summary
Questo protocollo presenta un modello murino standardizzato di espansione della sutura e un metodo di visualizzazione 3D per studiare i cambiamenti meccanobiologici della sutura e il rimodellamento osseo sotto carico di forza di trazione.
Abstract
Le suture craniofacciali svolgono un ruolo cruciale oltre ad essere articolazioni fibrose che collegano le ossa craniofacciali; Servono anche come nicchia primaria per la crescita delle ossa calvari e facciali, ospitando cellule staminali mesenchimali e osteoprogenitori. Poiché la maggior parte delle ossa craniofacciali si sviluppa attraverso l’ossificazione intramembranosa, le regioni marginali delle suture fungono da punti di inizio. A causa di questa importanza, queste suture sono diventate bersagli intriganti nelle terapie ortopediche come l’espansione della volta cranica assistita da molle, la rapida espansione mascellare e la protrazione mascellare. Sotto la forza di tracciamento ortopedico, le cellule staminali di sutura vengono attivate rapidamente, diventando una fonte dinamica per il rimodellamento osseo durante l’espansione. Nonostante la loro importanza, i cambiamenti fisiologici durante i periodi di rimodellamento osseo rimangono poco compresi. I metodi di sezionamento tradizionali, principalmente in direzione sagittale, non catturano i cambiamenti completi che si verificano durante l’intera sutura. Questo studio ha stabilito un modello murino standard per l’espansione della sutura sagittale. Per visualizzare completamente i cambiamenti di rimodellamento osseo dopo l’espansione della sutura, il metodo di pulizia dei tessuti PEGASOS è stato combinato con la colorazione EdU a montaggio intero e la doppia marcatura chelante del calcio. Ciò ha permesso la visualizzazione di cellule altamente proliferanti e la formazione di nuovo osso in tutte le ossa calvari dopo l’espansione. Questo protocollo offre un modello murino standardizzato di espansione della sutura e un metodo di visualizzazione 3D, facendo luce sui cambiamenti meccanobiologici nelle suture e nel rimodellamento osseo sotto carico di forza di trazione.
Introduction
Le suture craniofacciali sono tessuti fibrosi che collegano le ossa craniofacciali e svolgono un ruolo essenziale nella crescita e nel rimodellamento delle ossa craniofacciali. La struttura della sutura assomiglia a un fiume, fornendo un flusso di risorse cellulari per nutrire e costruire la “riva del fiume”, nota come fronti osteogenici, che contribuiscono alla formazione delle ossa craniofacciali attraverso l’osteogenesi intramembranosa1.
L’interesse per le suture craniofacciali è stato guidato dalle esigenze cliniche di comprendere la chiusura prematura delle suture craniche e la disfunzione della sutura facciale, che può portare a deformità craniofacciali e persino a condizioni pericolose per la vita nei bambini. La suturectomia a cielo aperto è utilizzata di routine nel trattamento clinico, ma il follow-up a lungo termine ha mostrato una recidiva di reossificazione incompleta in alcuni pazienti2. La craniotomia minimamente invasiva assistita da molle di espansione o craniectomia endoscopica a strisce può fornire un approccio più sicuro per preservare la potenziale sutura piuttosto che scartare i tessuti3. Allo stesso modo, le terapie ortopediche come le maschere facciali e gli apparecchi di espansione sono state ampiamente utilizzate per trattare l’ipoplasia sagittale o mascellare orizzontale, con alcuni studi che estendono il limite di età per il trattamento di pazienti adulti tramite espansori palatali assistiti da miniviti 4,5,6. Inoltre, la rigenerazione della sutura cranica con cellule staminali mesenchimali (MSC) combinate con materiali biodegradabili è una potenziale terapia in futuro, offrendo una nuova direzione per il trattamento delle malattie correlate7. Tuttavia, il processo funzionale o il meccanismo di regolazione delle suture rimane sfuggente.
Il rimodellamento osseo consiste principalmente in un equilibrio tra la formazione ossea condotta dagli osteoblasti e il riassorbimento osseo condotto dagli osteoclasti, dove la differenziazione osteogenica delle cellule staminali stimolate da segnali meccanici gioca un ruolo importante. Dopo decenni di ricerca, è stato scoperto che le suture craniofacciali sono nicchie di cellule staminali mesenchimali altamente plastiche8. Le cellule staminali di sutura (SuSC) sono un gruppo eterogeneo di cellule staminali, appartenenti alle cellule staminali mesenchimali (MSC) o alle cellule staminali ossee (SSC). Le SuSC sono marcate in vivo da quattro marcatori, tra cui Gli1, Axin2, Prrx1 e Ctsk. Le SuSC Gli1+ , in particolare, hanno rigorosamente verificato le caratteristiche biologiche delle cellule staminali, non solo esibendo un’elevata espressione dei tipici marcatori delle MSC, ma dimostrando anche un eccellente potenziale osteogenico e condrogenico9. Ricerche precedenti hanno dimostrato che le SuSC Gli1+ contribuiscono attivamente alla formazione di nuovo osso sotto la forza di trazione, identificandole come la fonte di cellule staminali della sutura che supporta l’osteogenesi da distrazione10.
In passato, sono state studiate in vitro ampie caratteristiche meccaniche delle cellule staminali tramite Flexcell, piegatura a quattro punti, sistema di caricamento a micromagnete e altri. Sebbene le cellule mesenchimali derivate dalla sutura cranica di topo siano state identificate in vitro11 e le cellule staminali mesenchimali da sutura umana siano state isolate di recente12, la risposta biomeccanica delle cellule di sutura rimane poco chiara nel sistema in vitro. Per studiare ulteriormente il processo di rimodellamento osseo, è stato stabilito un modello di espansione della sutura basato sulla coltura isolata di organi di calvaria, aprendo la strada alla creazione di un utile modello di espansione della sutura in vivo 1,13. I conigli14 e i ratti15 sono stati gli animali più utilizzati nella ricerca di base per l’espansione della sutura. Tuttavia, i topi sono modelli animali preferiti per esplorare le malattie umane a causa del loro genoma altamente omologo con gli esseri umani, delle numerose linee di modificazione genica e della forte capacità di ibridazione riproduttiva. I modelli murini esistenti di espansione della sutura cranica in genere si basano su fili elastici ortodontici in acciaio inossidabile per applicare una forza di trazione alla sutura sagittale16,17. In questi modelli, vengono praticati due fori su ciascun lato delle ossa parietali per fissare il dispositivo di espansione e i fili sono incorporati sotto la pelle, il che può influire sulla modalità di attivazione cellulare.
Per quanto riguarda il metodo di visualizzazione, l’osservazione bidimensionale delle fette in direzione sagittale è stata generalmente adottata per decenni. Tuttavia, considerando che il rimodellamento osseo è un complesso processo dinamico tridimensionale, ottenere informazioni tridimensionali complete è diventata un’esigenza urgente. La tecnica di trasparenza tissutale PEGASOS è emersa per soddisfare questo requisito18,19. Offre vantaggi unici per la trasparenza dei tessuti duri e molli, consentendo di riprodurre l’intero processo di rimodellamento osseo nello spazio tridimensionale.
Per ottenere una comprensione più profonda e completa dei cambiamenti fisiologici nei periodi di rimodellamento osseo, è stato stabilito un modello murino standard di espansione della sutura sagittale con un’impostazione a molla tra i supporti fatti a mano10. Con una procedura standardizzata di mordenzatura e incollaggio acido, il dispositivo di espansione potrebbe essere saldamente legato all’osso cranico, generando una forza di trazione perpendicolare alla sutura sagittale. Inoltre, il metodo di purificazione del tessuto PEGASOS è stato applicato dopo la doppia marcatura dell’osso mineralizzato post-espansione per visualizzare completamente i cambiamenti di modellazione ossea dopo l’espansione della sutura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo applicato un modello murino di espansione della sutura standard per osservare i regolari cambiamenti morfologici che si verificano ogni settimana durante l’intero ciclo di rimodellamento della durata di un mese10. Questo modello è utile per la ricerca sul rimodellamento e la rigenerazione dell’osso calvario mediante l’espansione delle suture calvariali, nonché per lo studio di varie cellule di sutura in vivo. Per presentare in modo completo i risultati di tale ricerca, è necess…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo per la piattaforma di laboratorio e l’assistenza dell’Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Pujiang di Shanghai (22PJ1409200); Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (No.11932012); Fondazione per la ricerca scientifica post-dottorato del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina dell’Università Jiao Tong di Shanghai; Finanziamento del programma di ricerca fondamentale del Nono Ospedale del Popolo affiliato alla Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
Referências
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