봉합사 확장 마우스 모델의 뼈 리모델링을 위한 3D 시각화 기법
Summary
이 프로토콜은 인장력 하중 하에서 봉합사 및 뼈 리모델링의 기계적 생물학적 변화를 연구하기 위해 표준화된 봉합사 확장 마우스 모델과 3D 시각화 방법을 제시합니다.
Abstract
두개안면 봉합사는 두개안면 뼈를 연결하는 섬유성 관절을 넘어 중요한 역할을 합니다. 그들은 또한 종변 및 안면 뼈 성장을 위한 주요 틈새 시장 역할을 하며, 중간엽 줄기 세포와 골전구 세포를 수용합니다. 대부분의 두개안면골은 막내 골화를 통해 발달하기 때문에 봉합사의 가장자리 영역이 시작 지점 역할을 합니다. 이러한 중요성으로 인해 이러한 봉합사는 스프링 보조 두개골 금고 확장, 빠른 상악 확장 및 상악 연장과 같은 정형외과 치료에서 흥미로운 표적이 되었습니다. 정형외과적 추적력에 따라 봉합사 줄기세포가 빠르게 활성화되어 확장 중 뼈 리모델링을 위한 동적 소스가 됩니다. 그 중요성에도 불구하고 뼈 리모델링 기간 동안의 생리학적 변화는 잘 이해되지 않고 있습니다. 주로 시상 방향의 전통적인 절편 방법은 전체 봉합사에서 발생하는 포괄적인 변화를 포착하지 못합니다. 이 연구는 시상 봉합사 확장을 위한 표준 마우스 모델을 확립했습니다. 봉합사 확장 후 뼈 리모델링 변화를 완전히 시각화하기 위해 PEGASOS 조직 투명화 방법을 전체 마운트 EdU 염색 및 칼슘 킬레이트 이중 라벨링과 결합했습니다. 이를 통해 고도로 증식하는 세포와 확장 후 전체 종골 뼈에 걸쳐 새로운 뼈 형성을 시각화할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 표준화된 봉합사 확장 마우스 모델과 3D 시각화 방법을 제공하여 인장력 하중 하에서 봉합사 및 뼈 리모델링의 기계적 생물학적 변화를 밝힙니다.
Introduction
두개안면 봉합사는 두개안면골을 연결하고 두개안면골의 성장과 리모델링에 필수적인 역할을 하는 섬유 조직입니다. 봉합사의 구조는 강을 닮았으며, 골형성 전선(osteogenic fronts)으로 알려진 “강둑”에 영양을 공급하고 구축하기 위한 세포 자원의 흐름을 제공하며, 이는 골막내 골형성(intraembranous osteogenesis)을 통해 두개안면골의 형성에 기여한다1.
두개안면 봉합사에 대한 관심은 두개안면 봉합사의 조기 폐쇄 및 안면 봉합사 기능 장애를 이해하려는 임상적 요구에 의해 주도되었으며, 이는 두개안면 기형과 어린이의 생명을 위협하는 상태로 이어질 수 있습니다. 개복 봉합 절제술은 임상 치료에 일상적으로 사용되지만, 일부 환자에서는 장기 추적 관찰 결과 불완전한 재골화가 재발하는 것으로 나타났다2. 확장 스프링이나 내시경 줄무늬 두개골 절제술을 이용한 최소 침습적 개두술은 조직을 폐기하는 것보다 잠재적인 봉합사를 보존하는 더 안전한 방법을 제공할 수 있다3. 마찬가지로, 안면 마스크 및 확장 장치와 같은 정형외과 치료법은 시상 또는 수평 상악 형성 부전을 치료하는 데 널리 사용되어 왔으며, 일부 연구에서는 미니 스크류 보조 구개 확장기를 통해 성인 환자를 치료할 수 있도록 연령 제한을 연장했습니다 4,5,6. 또한 생분해성 물질과 결합된 중간엽 줄기세포(MSC)를 사용한 두개골 봉합사 재생은 관련 질병 치료에 대한 새로운 방향을 제시하는 미래의 잠재적인 치료법입니다7. 그러나 봉합사의 기능 과정이나 조절 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다.
골리모델링은 주로 조골세포에 의한 골 형성과 파골세포에 의한 골흡수 사이의 균형으로 이루어지며, 기계적 신호에 의해 자극된 줄기세포의 골형성 분화가 중요한 역할을 합니다. 수십 년간의 연구 끝에 두개안면 봉합사는 매우 가소성 중간엽 줄기세포 틈새라는 것이 밝혀졌다8. 봉합사 줄기 세포(SuSC)는 중간엽 줄기 세포(MSC) 또는 뼈 줄기 세포(SSC)에 속하는 이종 줄기 세포 그룹입니다. SuSC는 in vivo 에서 Gli1, Axin2, Prrx1 및 Ctsk를 포함한 4가지 마커로 표지됩니다. 특히 Gli1+ SuSC는 줄기세포의 생물학적 특성을 엄격하게 검증하여 전형적인 MSC 마커의 발현이 높을 뿐만 아니라 우수한 골형성 및 연골 가능성을 입증했습니다9. 이전 연구에 따르면 Gli1+ SuSC는 인장력 하에서 새로운 뼈 형성에 적극적으로 기여하여 산만 골형성을 지원하는 봉합사 줄기 세포 공급원으로 확인되었습니다10.
과거에는 Flexcell, 4점 굽힘, 미세 자석 로딩 시스템 등을 통해 줄기세포의 광범위한 기계적 특성을 시험관 내에서 연구했습니다. 쥐 두개골 봉합사 유래 중간엽 세포가 in vitro11에서 확인되었고, 인간 봉합사 중간엽 줄기 세포도 최근12 분리되었지만, in vitro 시스템에서 봉합사 세포의 생체역학적 반응은 여전히 불분명하다. 뼈 리모델링 과정을 더 자세히 조사하기 위해 분리된 종골변 장기 배양을 기반으로 한 봉합사 확장 모델이 확립되어 유용한 생체 내 봉합사 확장 모델 1,13을 확립할 수 있는 길을 열었습니다. 토끼(14)와 쥐(15)는 봉합사 확장을 위한 기초 연구에서 가장 널리 사용되는 동물이다. 그러나 마우스는 인간과의 높은 상동 게놈, 수많은 유전자 변형 라인 및 강력한 생식 교잡 능력으로 인해 인간 질병을 탐구하는 데 선호되는 동물 모델입니다. 두개골 봉합사 확장의 기존 마우스 모델은 전형적으로 시상 봉합사(16,17)에 인장력을 가하기 위해 스테인리스강 교정 스프링 와이어에 의존한다. 이 모델에서는 확장 장치를 고정하기 위해 정수리 뼈의 양쪽에 두 개의 구멍을 만들고 와이어를 피부 아래에 매립하여 세포 활성화 모드에 영향을 줄 수 있습니다.
시각화 방법과 관련하여 시상 방향의 슬라이스를 2차원으로 관찰하는 것은 수십 년 동안 일반적으로 채택되어 왔습니다. 그러나 뼈 리모델링이 복잡한 3차원 동적 과정이라는 점을 고려할 때 완전한 3차원 정보를 얻는 것이 시급한 과제가 되었습니다. PEGASOS 조직 투명성 기술은 이 요구 사항18,19을 충족하기 위해 등장했습니다. 그것은 단단한 조직과 연약한 조직의 투명도를 위한 유일한 이점을 제안해, 완전한 뼈 개조 과정이 3차원 공간에서 재생되는 것을 가능하게 하.
뼈 리모델링 기간의 생리적 변화를 보다 심층적이고 포괄적으로 이해하기 위해, 핸드메이드 홀더 사이에 스프링 설정이 있는 표준 시상 봉합사 확장 마우스 모델을 구축하였다10. 표준화된 산 에칭 및 접착 절차를 통해 팽창 장치를 두개골에 단단히 접착하여 시상 봉합사에 수직인 인장력을 생성할 수 있습니다. 또한, 봉합사 확장 후 뼈 모델링 변화를 완전히 시각화하기 위해 확장 후 광물화된 뼈의 이중 표지 후 PEGASOS 조직 투명화 방법을 적용했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표준 봉합사 확장 마우스 모델을 적용하여 한 달간의 전체 리모델링 주기 동안 매주 발생하는 규칙적인 형태학적 변화를 관찰했습니다10. 이 모델은 종변 봉합사를 확장하여 종아리골 리모델링 및 재생을 연구하고 생체 내에서 다양한 봉합사 세포를 연구하는 데 유용합니다. 이러한 연구 결과를 완전히 제시하기 위해서는 염색된 조직의 3차원 시각화가 필요합니다. 따라?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Shanghai Jiaotong University School of Medicine의 Ear Institute의 실험실 플랫폼과 지원에 감사드립니다. 이 작업은 Shanghai Pujiang Program(22PJ1409200)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (No.11932012); 상하이 제9인민병원, 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 박사후 과학 연구 재단; 상하이 자오퉁 대학교 의과대학(JYZZ154) 부속 제9인민병원의 기초 연구 프로그램 자금 지원.
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
Referências
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