Методика 3D-визуализации для ремоделирования костной ткани в мышиной модели с расширением шва
Summary
Данный протокол представляет собой стандартизированную мышиную модель расширения шовного материала и метод 3-D визуализации для изучения механобиологических изменений шва и ремоделирования кости при растягивающей силе.
Abstract
Черепно-лицевые швы играют решающую роль, помимо того, что они являются фиброзными суставами, соединяющими черепно-лицевые кости; Они также служат основной нишей для роста костей черепа и лица, вмещая мезенхимальные стволовые клетки и остеопредшественники. Поскольку большинство черепно-лицевых костей развиваются путем внутренней мембранозной оссификации, краевые участки швов действуют как точки инициации. Из-за этой значимости эти швы стали интригующими мишенями в ортопедической терапии, такой как пружинное расширение свода черепа, быстрое расширение верхней челюсти и протрация верхней челюсти. Под действием ортопедической силы шовные стволовые клетки быстро активируются, становясь динамическим источником для ремоделирования кости во время расширения. Несмотря на их важность, физиологические изменения в периоды ремоделирования костной ткани остаются малоизученными. Традиционные методы секционирования, в первую очередь в сагиттальном направлении, не охватывают комплексных изменений, происходящих по всему шву. В этом исследовании была создана стандартная мышиная модель расширения сагиттального шва. Чтобы полностью визуализировать изменения ремоделирования костной ткани после расширения шва, метод очистки тканей PEGASOS был объединен с окрашиванием EdU и двойным мечением хелатированием кальция. Это позволило визуализировать высокопролиферирующие клетки и образование новой костной ткани по всей костной кости после расширения. Этот протокол предлагает стандартизированную мышиную модель расширения шовного материала и метод 3-D визуализации, проливающий свет на механобиологические изменения в швах и ремоделирование кости при растягивающей силе.
Introduction
Черепно-лицевые швы представляют собой волокнистые ткани, которые соединяют черепно-лицевые кости и играют важную роль в росте и ремоделировании черепно-лицевых костей. Структура шва напоминает реку, обеспечивая приток клеточных ресурсов для питания и построения «берега реки», известного как остеогенные фронты, которые способствуют формированию черепно-лицевых костей посредством интрамембранозного остеогенеза1.
Интерес к черепно-лицевым швам был обусловлен клиническими потребностями в понимании преждевременного закрытия черепных швов и дисфункции лицевых швов, которые могут привести к черепно-лицевым деформациям и даже опасным для жизни состояниям у детей. Открытая шовная хирургия обычно используется в клиническом лечении, но длительное наблюдение показало неполный рецидив повторного окостенения у некоторых пациентов2. Минимально инвазивная трепанация черепа с помощью расширительных пружин или эндоскопическая полосковая краниэктомия может обеспечить более безопасный подход к сохранению потенциального шва, а не к отбрасыванию тканей3. Аналогичным образом, ортопедические методы лечения, такие как маски для лица и расширительные устройства, широко используются для лечения сагиттальной или горизонтальной гипоплазии верхней челюсти, при этом некоторые исследования расширяют возрастные ограничения для лечения взрослых пациентов с помощью минивинтовых расширителей неба 4,5,6. Кроме того, регенерация краниальных швов с помощью мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в сочетании с биоразлагаемыми материалами является потенциальной терапией в будущем, предлагая новое направление для лечения родственных заболеваний7. Тем не менее, функциональный процесс или регуляторный механизм швов остается неуловимым.
Ремоделирование костной ткани в основном состоит из баланса между костным образованием, осуществляемым остеобластами, и костной резорбцией, проводимой остеокластами, где важную роль играет остеогенная дифференцировка стволовых клеток, стимулируемая механическими сигналами. После десятилетий исследований было установлено, что черепно-лицевые швы представляют собой высокопластичные ниши мезенхимальных стволовых клеток8. Шовные стволовые клетки (SuSC) представляют собой гетерогенную группу стволовых клеток, принадлежащих к мезенхимальным стволовым клеткам (МСК) или костным стволовым клеткам (SSC). SuSC мечаются in vivo четырьмя маркерами, включая Gli1, Axin2, Prrx1 и Ctsk. В частности, SuSC Gli1+ строго верифицировали биологические характеристики стволовых клеток, не только демонстрируя высокую экспрессию типичных маркеров МСК, но и демонстрируя превосходный остеогенный и хондрогенный потенциал9. Предыдущие исследования показали, что SuSC Gli1+ активно способствуют формированию новой костной ткани под действием растягивающей силы, что позволяет идентифицировать их как источник шовных стволовых клеток, поддерживающий дистракционный остеогенез10.
В прошлом обширные механические характеристики стволовых клеток изучались in vitro с помощью Flexcell, четырехточечного изгиба, системы микромагнитной нагрузки и других. Несмотря на то, что мезенхимальные клетки, полученные из черепного шва мышей, были идентифицированы in vitro11, а мезенхимальные стволовые клетки человеческого шовного материала также были выделены недавно12, биомеханический ответ шовных клеток в системе in vitro остается неясным. Для дальнейшего изучения процесса ремоделирования костной ткани была создана модель расширения шва, основанная на изолированной культуре органов кальварии, что проложило путь к созданию полезной модели расширения шовного материала in vivo 1,13. Кролики14 и крысы15 были наиболее широко используемыми животными в фундаментальных исследованиях для расширения шва. Тем не менее, мыши являются предпочтительными животными моделями для изучения болезней человека из-за их высокогомологичного генома с человеческим, многочисленных линий модификации генов и сильной способности к репродуктивной гибридизации. Существующие мышиные модели расширения черепного шва обычно полагаются на ортодонтические пружинные проволоки из нержавеющей стали для приложения растягивающего усилия к сагиттальному шву 16,17. В этих моделях с каждой стороны теменных костей проделываются по два отверстия для фиксации расширительного устройства, а провода встроены под кожу, что может повлиять на режим активации клеток.
Что касается метода визуализации, то двумерное наблюдение срезов в сагиттальном направлении было принято в течение десятилетий. Однако, учитывая, что ремоделирование костной ткани является сложным трехмерным динамическим процессом, получение полной трехмерной информации стало насущной необходимостью. Для удовлетворения этого требования появился метод прозрачности тканей PEGASOS18,19. Он обладает уникальными преимуществами прозрачности твердых и мягких тканей, позволяя воспроизводить весь процесс ремоделирования кости в трехмерном пространстве.
Для получения более глубокого и всестороннего понимания физиологических изменений в периоды ремоделирования костной ткани была создана стандартная модель мыши с расширением сагиттального шва с пружинной установкой между самодельными держателями10. С помощью стандартизированной процедуры кислотного травления и склеивания расширительное устройство может быть прочно прикреплено к черепной кости, создавая растягивающее усилие, перпендикулярное сагиттальному шву. Кроме того, метод очистки тканей PEGASOS был применен после двойного мечения минерализованной кости после расширения, чтобы полностью визуализировать изменения моделирования кости после расширения шва.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы применили стандартную мышиную модель расширения шва для наблюдения за регулярными морфологическими изменениями, которые происходят каждую неделю в течение всего месячногоцикла ремоделирования. Эта модель полезна для исследования ремоделирования и регенерации костн…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим за лабораторную платформу и помощь Институт уха Шанхайского университета Цзяотун на медицинском факультете. Эта работа была поддержана Шанхайской программой Пуцзян (22PJ1409200); Национальный фонд естественных наук Китая (No 11932012); Научно-исследовательский фонд Шанхайской девятой народной больницы, Медицинский факультет Шанхайского университета Цзяотун; Финансирование программы фундаментальных исследований Девятой народной больницы при Медицинской школе Шанхайского университета Цзяотун (JYZZ154).
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
Referências
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
