Раннее неуправляемое моделирование органоидной нейроваскулярной ниши головного мозга человека в пермиссивной хориоаллантоической мембране эмбриона цыпленка
Summary
Здесь мы представляем протокол по приживлению органоидов головного мозга человека на нескольких стадиях созревания в хориоаллантоисную мембрану (CAM) цыплят. Органоиды головного мозга выращивались в соответствии с неуправляемыми стандартизированными протоколами.
Abstract
Приживление органоидов в васкуляризированные ткани модельных животных, таких как хориоаллантоическая мембрана (CAM) эмбрионов мышей или цыплят с иммунодефицитом, доказало свою эффективность для моделирования неоваскуляризации. CAM представляет собой богато васкуляризированную экстраэмбриональную мембрану, которая демонстрирует ограниченную иммунореактивность, что делает ее отличной моделью для трансплантации клеток человеческого происхождения.
В данной работе описывается стратегия приживления органоидов головного мозга человека, дифференцированных на нескольких стадиях созревания, в CAM. Клеточный состав органоидов головного мозга меняется со временем, отражая вехи развития мозга человека. Мы трансплантировали органоиды головного мозга на соответствующих стадиях созревания: нейроэпителиальная экспансия (18 DIV), ранний нейрогенез (60 DIV) и ранний глиогенез (180 DIV) в КАМ эмбриональных (E)7 куриных эмбрионов. Через 5 дней забирали приживленные органоиды головного мозга и анализировали их гистологические особенности.
Гистологических признаков неоваскуляризации в трансплантированных органоидах или аномальных кровеносных сосудах, прилегающих к трансплантатам, не выявлено. Более того, наблюдались заметные изменения в клеточном составе трансплантированных органоидов, а именно увеличение количества глиальных фибриллярных кислых белково-позитивно-реактивных астроцитов. Однако цитоархитектурные изменения зависели от стадии органоидного созревания. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что органоиды мозга могут расти в CAM, и они показывают различия в цитоархитектонике в зависимости от стадии их созревания при трансплантации.
Introduction
Органоиды человеческого мозга – это новый метод, который позволяет нам повторить раннее развитие человеческого мозга in vitro 1,2,3. Тем не менее, одним из основных ограничений этой модели является отсутствие васкуляризации, которая играет незаменимую роль не только в гомеостазе мозга, но ив развитии мозга. В дополнение к доставке кислорода и питательных веществ, накопленные данные свидетельствуют о том, что сосудистая система мозга регулирует дифференцировку нейронов, миграцию и синаптогенез во время развития 5,6. Таким образом, существует острая необходимость в создании надежных моделей, которые могут обеспечить недостающую сосудистую сигнализацию и структуру органоидов головного мозга, повышая сложность органоидов мозга человека7-го поколения.
Среди предложенных методов васкуляризации можно рассмотреть два основных направления: приживление органоидов в живой организм и чисто in vitro технологии совместного культивирования эндотелиальных и нервных клеток 8,9,10,11,12. Внутримозговая трансплантация у мышей является дорогостоящей и трудоемкой процедурой, что делает другие технологии актуальными для более простых моделей. Анализ хориоаллантоической мембраны цыплят (CAM) широко использовался для изучения ангиогенеза 13,14,15. За последнее десятилетие несколько групп успешно внедрили различные типы органоидов, включая почку16,17, сердечную18 и опухолевую органоиды19,20, в КАМ. Тем не менее, мало что известно об эффективности, токсичности/отторжении, физиологическом эффекте и методах приживления органоидов человеческого мозга в CAM. Другим интересным и пока неизученным аспектом является формирование химерного гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) между КАМ и органоидным астроцитарным интерфейсом. Предыдущая новаторская работа предполагала предполагаемую возможность получения ГЭБ в CAM путем трансплантации астроцитов и астроцит-кондиционированной среды 21,22,23. Однако зрелые астроциты, по-видимому, не в состоянии достичь этогопоказателя 24,25. Таким образом, индуцированное астроцитами образование ГЭБ остается спорным, и трансплантация органоидов человеческого мозга позволила бы нам пролить свет на это противоречие.
В этой видеостатье описывается протокол трансплантации органоидов головного мозга человека in ovo в CAM, который способствует росту, улучшению и васкуляризации, в результате чего образуются органоиды, включающие гистологически совместимые элементы ГЭБ. Здесь мы представляем протокол, обеспечивающий выживание куриного эмбриона, и сообщаем о допустимости CAM для поддержания роста органоидов мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данном исследовании мы описываем подробный протокол с многочисленными ключевыми этапами, которые обеспечивают благоприятный рост и развитие органоидов головного мозга человека при трансплантации, не нарушая выживаемость куриных эмбрионов. Мы рекомендовали использовать стерильны…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Алькантару и д-ра Ортегу из UB, а также остальных сотрудников лаборатории д-ра Акосты за содержательные обсуждения. С.А. является доцентом Женералитата Каталонии в Университете Барселоны.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
Referências
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
