Tidig ostyrd human hjärnorganoid neurovaskulär nischmodellering i det tillåtande kycklingembryot korioallantoiskt membran
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att transplantera mänskliga hjärnorganoider i flera mognadsstadier i kycklingens korioallantoiska membran (CAM). Hjärnorganoider odlades enligt ostyrda standardiserade protokoll.
Abstract
Att transplantera organoider till vaskulariserade vävnader i modelldjur, såsom det immundefekta mus- eller kycklingembryot chorioallantoic membrane (CAM), har visat sig vara effektivt för neovaskulariseringsmodellering. CAM är ett rikt vaskulariserat extraembryonalt membran, som visar begränsad immunreaktivitet, och därmed blir en utmärkt värdmodell för celltransplantationer av mänskligt ursprung.
Denna artikel beskriver strategin för att transplantera mänskliga hjärnorganoider differentierade vid flera mognadsstadier i CAM. Den cellulära sammansättningen av hjärnorganoider förändras med tiden, vilket återspeglar milstolparna i den mänskliga hjärnans utveckling. Vi transplanterade hjärnorganoider vid relevanta mognadsstadier: neuroepitelexpansion (18 DIV), tidig neurogenes (60 DIV) och tidig gliogenes (180 DIV) i KAM hos embryonala dag (E)7 kycklingembryon. Transplanterade hjärnorganoider skördades 5 dagar senare och deras histologiska egenskaper analyserades.
Inga histologiska tecken på neovaskularisering i de transplanterade organoiderna eller onormala blodkärl intill transplantaten upptäcktes. Dessutom observerades anmärkningsvärda förändringar i den cellulära sammansättningen av de ympade organoiderna, nämligen en ökning av antalet gliafibrillära sura proteinpositiva-reaktiva astrocyter. De cytoarkitektoniska förändringarna var dock beroende av organoidens mognadsstadium. Sammantaget tyder dessa resultat på att hjärnorganoider kan växa i CAM, och de visar skillnader i cytoarkitekturen beroende på deras mognadsstadium vid transplantation.
Introduction
Mänskliga hjärnorganoider är en framväxande teknik som gör det möjligt för oss att rekapitulera den tidiga utvecklingen av den mänskliga hjärnan in vitro 1,2,3. Icke desto mindre är en av de största begränsningarna med denna modell bristen på vaskularisering, som spelar oumbärliga roller inte bara i hjärnans homeostas utan också i hjärnans utveckling4. Förutom tillförseln av syre och näringsämnen tyder allt fler bevis på att hjärnans kärlsystem reglerar neural differentiering, migration och synaptogenes under utvecklingen 5,6. Därför finns det ett akut behov av att etablera tillförlitliga modeller som kan ge den saknade vaskulära signaleringen och strukturen till hjärnorganoider, vilket ökar komplexiteten hos mänsklig hjärnorganoid generation7.
Bland de föreslagna metoderna för vaskularisering kan två huvudsakliga strömlinjer övervägas: organoidinympning i en levande organism och rent in vitro-teknik samodling av endotelceller och neurala celler 8,9,10,11,12. Intracerebral transplantation på möss är kostsamt och tidskrävande, vilket gör andra tekniker relevanta för enklare modeller. Chick chorioallantoic membrane (CAM) -analysen har använts i stor utsträckning för att studera angiogenes 13,14,15. Under det senaste decenniet har flera grupper framgångsrikt transplanterat olika typer av organoider, inklusive njure16,17, hjärta18 och tumörorganoider19,20, till KAM. Ändå är lite känt om effektivitet, toxicitet/avstötning, fysiologisk effekt och metoder för att transplantera mänskliga hjärnorganoider i CAM. En annan intressant och ännu outforskad aspekt är bildandet av en chimär blod-hjärnbarriär (BBB) mellan KAM och det organoida astrocytiska gränssnittet. Tidigare banbrytande arbete föreslog den förmodade möjligheten att generera en BBB i CAM genom att transplantera astrocyter och astrocytbetingat medium 21,22,23. Mogna astrocyter verkar dock inte kunna uppnå detta24,25. Således är den astrocyt-inducerade bildningen av BBB fortfarande diskutabel, och transplantation av mänskliga hjärnorganoider skulle göra det möjligt för oss att kasta ljus över denna kontrovers.
Den här videoartikeln beskriver ett protokoll för en transplantation av mänskliga hjärnorganoider till KAM som främjar tillväxt, förbättring och vaskularisering, vilket resulterar i organoider som omfattar histologiskt kompatibla BBB-element. Här presenterar vi ett protokoll som säkerställer överlevnaden av kycklingembryot och rapporterar om KAM-toleransen för att upprätthålla hjärnans organoidtillväxt.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie beskriver vi ett detaljerat protokoll med många nyckelsteg som ger gynnsam tillväxt och utveckling av mänskliga hjärnorganoider vid transplantation utan att störa överlevnaden av kycklingembryona. Vi rekommenderade användning av sterila nålar för att punktera äggets luftkammare efter 24 timmars inkubation (dag 1). Dessutom försökte vi också göra punkteringen på dag 4 (efter att ha kontrollerat genom äggskalet med ljus för att testa utvecklingen av kärlen för att vara säkra på att vi ba…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Alcántara och Dr. Ortega från UB och resten av medlemmarna i Dr. Acostas labb för de insiktsfulla diskussionerna. S.A. är Serra-Hunter-kollega från Generalitat de Catalunya vid Universitat de Barcelona.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
Referências
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
