Drosophila er en veletableret model til undersøgelse af nøglemolekyler, der regulerer myogenese. Imidlertid er de nuværende metoder utilstrækkelige til at bestemme mRNA-transkriptionsdynamik og rumlig fordeling inden for syncyti. For at løse denne begrænsning optimerede vi en RNA-fluorescens de situ-hybridiseringsmetode, der muliggør påvisning og kvantificering af mRNA’er på en enkeltmolekyleskala.
Skeletmuskler er store syncytia bestående af mange bundtede myofibre, der producerer kræfter og muliggør kropsbevægelse. Drosophila er en klassisk model til at studere muskelbiologi. Kombinationen af både Drosophila-genetik og avancerede omics-tilgange førte til identifikation af vigtige konserverede molekyler, der regulerer muskelmorfogenese og regenerering. Imidlertid kan transkriptionsdynamikken af disse molekyler og den rumlige fordeling af deres messenger-RNA inden for syncytia ikke vurderes ved konventionelle metoder. Her optimerede vi en eksisterende enkeltmolekyle RNA-fluorescens in situ hybridiseringsmetode (smFISH) for at muliggøre påvisning og kvantificering af individuelle mRNA-molekyler i voksne flyvemuskler og deres muskelstamceller. Som et bevis på konceptet har vi analyseret mRNA-ekspressionen og fordelingen af to evolutionære konserverede transkriptionsfaktorer, Mef2 og Zfh1 / Zeb. Vi viser, at denne metode effektivt kan detektere og kvantificere enkelte mRNA-molekyler for både transkripter i muskelforløberceller, voksne muskler og muskelstamceller.
Voksne skeletmuskler er lavet af differentierede multinucleated myofibre, hvis kontraktile egenskaber genererer bevægelser. Muskelvækst, vedligeholdelse og regenerering er afhængig af muskelstamceller og muskelstamceller (MuSC’er), der er specificeret under embryonal udvikling1. Det myogene program styres fint af et sæt kernemyogene transkriptionsfaktorer (TF’er) (f.eks. Pax3/7, MYOD, Mef2 og ZEB)2,3,4. Dekryptering af de molekylære mekanismer, der regulerer muskelbiologi, er vigtig for at belyse grundlæggende myologirelaterede spørgsmål og for mulig terapeutisk anvendelse til behandling af muskeldegenerative sygdomme.
Drosophila har en lang historie som en genetisk model til at studere myogenese5. Det er for nylig opstået som en ny model til at undersøge muskelregenerering 6,7,8. Muskelstrukturen og kernemyogene programmer er stærkt bevaret mellem fluer og pattedyr. For eksempel har TF’erne Mef2 og Zfh1 / ZEB en bevaret funktion til regulering af muskeludvikling og regenerering 3,9,10,11. Voksne Drosophila-muskler, såsom indirekte flyvemuskler (IFM’er), dannes af en bestemt population af MuSC’er, kendt som voksne muskelstamfædre (AMP’er)12. Disse AMP’er specificeres under embryogenese og associeres med epitelstrukturer såsom vinge- og benskiver. Gennem embryonale og larvestadier forbliver AMP’er udifferentierede indtil metamorfose, når de engagerer sig i differentiering og fusion for at danne IFM’erne13,14. TF Spalt major (spalt, salm) udtrykkes under flyvemuskeludvikling og er nødvendig for at bestemme deres strukturelle identitet15. Mef2 er en anden vigtig myogen TF, der er afgørende for voksen muskeldannelse 16,17. Det udtrykkes i AMP’erne og vedligeholdes i IFM’erne10,18 for voksne. Mens størstedelen af AMP’er differentierer sig til funktionelle muskler, undgår en delmængde differentiering og danner de voksne MuSC’er11. I lighed med hvirveldyr er TF Zfh1/ZEB nødvendig for at forhindre for tidlig differentiering af de voksne MuSC’er og for at bevare deres stilk 9,10.
Genekspressionsdynamik har vist sig at regulere forskellige muskelbiologiske processer19,20. Fremkomsten af højkapacitets enkeltcelle- og enkeltkerner RNA-sekventeringsteknikker har muliggjort en omfattende udforskning af disse transkriptionelle dynamikker21,22. En bemærkelsesværdig begrænsning af disse tilgange er deres manglende evne til at tilvejebringe den rumlige fordeling af mRNA-molekyler i de multinucleerede muskelfibre. Disse egenskaber kan undersøges ved enkeltmolekylefluorescens in situ-hybridisering (smFISH), der afslører to typer mRNA-legemer: 1. Individuelle mRNA-molekyler spredt ud i cytoplasmaet og repræsenterer det modne RNA og 2. Højst to lyse nukleare foci svarer til det spirende transkript og afslører de transkriptionelt aktive alleler23. Derfor er smFISH en metode til valg til individuel mRNA-molekylekvantificering, der undersøger deres rumlige fordeling og giver snapshots af gentranskriptionsdynamikken.
smFISH-metoden er afhængig af et sæt korte fluorescerende oligonukleotidprober, der er specielt designet til at være komplementære til måltranskriptet. Efter udglødning genererer den punktkilder med høj intensitet, der tillader påvisning af mRNA på et enkeltmolekyleniveau ved hjælp af konfokal mikroskopi24. Denne metode anvendes i stigende grad til en lang række celletyper, herunder pattedyrs muskelvæv19,20. Men i Drosophila ligesom andre dyremodeller stammer det meste af viden om voksen muskelgenekspression fra bulkmolekylære assays, som mangler kvantitativ information om den rumlige placering af mRNA-molekyler. Her optimerede vi en metode til at udføre smFISH på muskelforløberceller og voksne Drosophila-muskler 23,25. Denne protokol inkluderer en fuldautomatisk analysepipeline til kernesegmentering og mRNA-tælling og lokalisering.
Anvendelsen af smFISH-metoden har vundet popularitet i nyere tid, hvor dens anvendelse strækker sig til forskellige celletyper og modelorganismer. I tilfælde af Drosophila stammer størstedelen af viden om voksen muskelgenekspression imidlertid fra bulkmolekylære assays, som ikke giver kvantitativ information om den præcise rumlige placering af mRNA-molekyler. For at afhjælpe dette hul har vi optimeret en metode til at udføre smFISH på muskelforløberceller og voksne Drosophila-muskler . Denne tilgang er blevet tilpasset fra en tidligere offentliggjort protokol23 og optimeret til Drosophila muskelvæv.
Den største hindring for at opnå smFISH-billeder af høj kvalitet er tykkelsen af voksne muskler, hvilket forhindrer optimal indtrængning af sonder. Derfor er det afgørende at adskille de voksne muskler fra dyrets andre væv og udføre hybridiseringsprocessen med mild omrøring. Dette særlige trin sikrer effektiv permeabilisering af vævene.
Et andet kritisk aspekt er, at signal-støj-forholdet kan få beregningsrørledningen til at mislykkes med at detektere visse mRNA-pletter. Vi fandt ud af, at øget signal-støj-forholdet kan opnås ved at finde den optimale koncentration af sonder. Den optimale fortynding kan variere afhængigt af sammensætningen af hvert sondesæt, herunder det konjugerede farvestof og oligonukleotidsammensætningen. Vi anbefaler at prøve forskellige fortyndinger; en endelig fortynding på 200 nM gav det bedste signal-støj-forhold for voksent væv i disse forsøg.
Med smFISH-metoden er det muligt at kvantificere antallet af nyligt syntetiserede RNA’er ved TS-foci. Når et gen transkriberes aktivt, produceres flere spirende RNA’er samtidigt ved TS. Som et resultat vil TS’s intensitet overgå den for modent cytoplasmatisk RNA, og denne funktion kombineret med dens nukleare lokalisering kan differentiere TS fra individuelle cytoplasmatiske RNA’er. I forbindelse med muskelbiologi er TS-detektion og kvantificering særlig vigtig for at bestemme synkroniseringen af transkription af et specifikt gen blandt muskelkerner inden for samme syncytium. Denne beregningsrørledning er imidlertid ikke designet til at skelne mellem cytoplasmatiske mRNA- og TS-signaler. Som et alternativ foreslår vi at kombinere denne smFISH-metode med andre veletablerede smFISH-analyseværktøjer, såsom BayFISH eller FISH-quant29,30. Disse værktøjer har vist sig at lette automatiseret segmentering og fluorescensintensitetsberegninger af RNA-aggregater med bemærkelsesværdig præcision.
Endelig, mens smFISH registrerer mRNA-molekyler med høj rumlig opløsning, er det begrænset til at analysere et lille antal mRNA på samme tid. Multiskalametoder som merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridisering) muliggør samtidig analyse af et stort antal forskellige mRNA31. Ved at kombinere oligonukleotidprober og fejlkorrigerende koder letter denne metode påvisning af hundredvis af RNA-arter i enkeltceller.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alain Vincent for hans kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker Ruth Lehmann for at levere Zfh1-antistoffet. Vi anerkender hjælpen fra Stephanie Dutertre og Xavier Pinson til konfokal mikroskopi på MRic Imaging Platform. EL er støttet af ph.d.-stipendium fra ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA støttes af AFM-Telethon Ph.D. stipendium 23846. TP finansieres af et Chan Zuckerberg Initiative DAF-tilskud til T.P. (2019-198009). HB støttes af CNRS, Atip Avenir-programmet og AFM-Telethon trampolintilskud 23108.
Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
Mef2 antibody | DHSB | NA | |
PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
Stellaris probes | LGC | NA | |
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |