用于评估蛋白水解靶向嵌合体（PROTACS）诱导的三元复合物形成的生物物理测定方法的发展和应用

Summary

在这里，我们描述了由蛋白水解靶向嵌合体 （PROTACS） 诱导的三元复合物形成的生物物理表征方案，这些嵌合体涉及泛素连接酶 Von Hippel-Lindau E3 连接酶 （VHL） 和 Cereblon （CRBN）。 本文说明的生物物理方法包括表面等离子体共振（SPR）、生物层干涉测量法（BLI）和等温滴定量热法（ITC）。

Abstract

靶向降解的 E3 连接酶和蛋白质可以在多步骤过程中通过异双功能分子诱导形成复合物。所涉及的相互作用的动力学和热力学有助于泛素化的效率和由此产生的蛋白质降解。表面等离子体共振 （SPR）、生物层干涉测量法 （BLI） 和等温滴定量热法 （ITC） 等生物物理技术提供了可用于优化这些相互作用的宝贵信息。使用两个模型系统，建立了一个生物物理测定工具包，用于了解三元复合物形成的协同作用以及“钩效应”对结合动力学的影响。在一个案例中，评估了蛋白水解靶向嵌合体 （PROTAC） 分子，该分子诱导 Brd4^BD2 和 VHL 之间形成三元复合物。异双功能分子 MZ1 对 Brd4^BD2 蛋白 （SPR K D = 1 nM， ITC K D = 4 nM） 和 VHL 复合物 （SPR K_D = 29 nM， ITC K _D = 66 nM） 具有 nM 亲和力。对于该系统，开发了强大的 SPR、BLI 和 ITC 检测方法，这些检测方法重现了已发表的结果，证明了三元复合物形成的协同作用。在另一种情况下，研究了一种在46.0 kDa蛋白PPM1D和cereblon[CRBN（319-442）]之间诱导三元复合物的分子。异双功能分子 BRD-5110 对 PPM1D 的 SPR K_D = 1 nM，但对截短的 CRBN （319-442） 复合物 （SPR K_D= ~ 3 μM） 的结合要弱得多。在这种情况下，SPR中CRBN的结合是不可饱和的，导致了“钩效应”。评估了 SPR、BLI 和 ITC 的通量和试剂要求，并提供了将其应用于 PROTAC 项目的一般建议。

Introduction

细胞中蛋白质的多泛素化是一个严格调节的过程，涉及泛素连接酶家族中的酶 ^1,2。该途径中的末端酶是 E3 泛素连接酶，它们将泛素分子共价连接到其蛋白质结合伙伴³。这些蛋白质结合伴侣的多泛素化靶向它们，以蛋白酶体⁴ 进行蛋白水解降解。该系统是蛋白质稳态过程的一部分，该过程已被用于治疗性地诱导与疾病⁵ 相关的蛋白质降解。诱导 E3 泛素连接酶之间相互作用的小分子，例如 Von Hippel-Lindau E3 连接酶 （VHL） 或 cereblon （CRBN），通常由 E3 连接酶结合弹头组成，该弹头通过柔性连接子连接到弹头，弹头与靶向降解的蛋白质结合。这些异双功能分子通常被称为靶向嵌合体的蛋白水解或PROTACS⁶。

PROTACS的开发涉及评估分子诱导细胞中蛋白质降解的能力。已经开发了许多细胞检测系统，用于监测用 PROTAC 分子处理细胞后靶蛋白和 E3 连接酶组分（如 VHL 或 CRBN）之间的诱导相互作用。nanoluc-Halotag 系统⁷ 是一种这样的细胞测定，涉及与 Halotag 受体融合的 E3 连接酶和用 nanoluc 供体标记的靶蛋白。三元络合物的形成使nanoluc供体和Halotag受体靠近，允许能量从供体转移到受体，从而产生光的发射。该系统的变化可用于评估 PROTACS 分子⁸ 的细胞通透性或靶蛋白泛素化相对水平的变化⁹。虽然这些细胞系统对于推动 PROTACS 的优化至关重要，但在 E3 连接酶和靶向降解的蛋白质之间形成复合物是一个多步骤过程^10,11。所涉及的二元和三元相互作用的动力学和热力学有助于蛋白质的效率泛素化和由此产生的降解^12,13,14。

本文所描述的方案可用于使用表面等离子体共振（SPR），生物层干涉测量法（BLI）和等温滴定量热法（ITC）对PROTACS诱导的三元复合物形成进行生物物理表征。MZ1 PROTAC 分子的 SPR 和 ITC 协议诱导 Brd4^BD2 和 VHL 之间形成三元复合物，源自文献报告^13,15，此处描述，能够通过对报告程序进行一些修改来概括报告的结果^，这将进行讨论。本报告描述了用于评估 MZI、Brd4^BD2 和 VHL 之间三元复合物形成的 BLI 测定。BLI 的亲和力测量值与 SPR 和 ITC 中观察到的亲和力测量值一致。还描述了先前发表的方案，其中开发了用于评估 PROTAC 诱导的 PPM1D（一种以 p53 依赖性方式诱导表达的 Ser/Thr 蛋白磷酸酶¹⁶）和 CRBN 之间形成的 SPR 测定法。在这种情况下，PROTAC 分子对 PPM1D 具有纳摩尔亲和力，但对 CRBN 只有微摩尔亲和力。在这种情况下，PROTAC分子与CRBN的结合是不饱和的，导致通常观察到的“钩效应”。钩效应是三个体系统的特性，其中当两个物种都与桥接分子结合时，可以形成异源三聚体复合物（图1）¹⁷。当桥接物种相对于其他两种物种浓度过高时，观察到钩效应。由此产生的状态是二元相互作用胜过三元相互作用的状态。观察到钩效应的系统需要本报告中讨论的特定实验设计考虑因素。提供了评估生物物理测定法用于评估PROTAC诱导的三元复合物形成的一般概念和试剂要求。

Protocol

所有蛋白质均在大 肠杆菌 中过表达，产量和纯度均>80%），遵循文献方案18。使用BirA催化的反应18进行生物素化。所有小分子均在1 mM储备溶液中在100%DMSO中制备。此处描述的程序不需要专门的实验室安全设备或预防措施。应使用标准的实验室个人防护装备 （PPE）（即实验室外套、护目镜和手套）。 本研究中应用的蛋白质如下：VHL?…

Representative Results

VHL：MZ1二元复合物和VHL：MZ1：Brd4BD2三元复合物的表征可以在图2（ITC）、图3（BLI）和图4（SPR）中找到，使用非常相似的缓冲液。从正交测定中提取的KD是一致的。合作性可以通过K D（二元）/KD（三元）来计算，这是非常正的（ITC为15，SPR为26）。 CRBN：PROTAC：PPM1D系统的表征由SP…

Discussion

PROTAC分子与其蛋白质结合伙伴之间的二元和三元相互作用的生物物理表征可以提供与广泛使用的细胞系统相关的独特和互补的见解。了解PROTAC分子的每个弹头与其蛋白质结合伙伴之间的亲和力有助于指导药物化学工作优化这些相互作用。先前发表的三元PROTAC复合物的晶体结构表明，连接区域中的原子可以与一个或两个蛋白质结合伙伴形成相互作用^16,20。…

Materials

96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments