Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur biophysikalischen Charakterisierung der ternären Komplexbildung, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert wird, an denen die Ubiquitin-Ligasen Von-Hippel-Lindau E3-Ligase (VHL) und Cereblon (CRBN) beteiligt sind. Zu den hier dargestellten biophysikalischen Methoden gehören die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC).

Abstract

E3-Ligasen und Proteine, die auf den Abbau abzielen, können durch heterobifunktionelle Moleküle in einem mehrstufigen Prozess dazu gebracht werden, Komplexe zu bilden. Die Kinetik und Thermodynamik der beteiligten Wechselwirkungen tragen zur Effizienz der Ubiquitinierung und des daraus resultierenden Abbaus des Proteins bei. Biophysikalische Techniken wie die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) liefern wertvolle Informationen, die bei der Optimierung dieser Wechselwirkungen verwendet werden können. Unter Verwendung von zwei Modellsystemen wurde ein biophysikalischer Assay-Toolkit zum Verständnis der Kooperativität der ternären Komplexbildung und des Einflusses des “Hook-Effekts” auf die Bindungskinetik entwickelt. In einem Fall wurde ein Proteolyse-Targeting-Chimären-Molekül (PROTAC) untersucht, das die ternäre Komplexbildung zwischen Brd4^BD2 und VHL induziert. Das heterobifunktionelle Molekül MZ1 hat nM-Affinitäten sowohl für das Brd4-BD2-Protein (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) als auch für den VHL-Komplex (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Für dieses System wurden robuste SPR-, BLI- und ITC-Assays entwickelt, die veröffentlichte Ergebnisse reproduzierten, die die Kooperativität der ternären Komplexbildung demonstrieren. Im anderen Fall wurde ein Molekül untersucht, das ternäre Komplexe zwischen einem 46,0 kDa-Protein, PPM1D, und Cereblon [CRBN (319-442)] induziert. Das heterobifunktionelle Molekül BRD-5110 hat eine SPR K D = 1 nM für PPM1D, aber eine viel schwächere Bindung gegen den verkürzten CRBN (319-442)-Komplex (SPR K_D = ~ 3 μM). In diesem Fall war die Bindung für CRBN in SPR nicht sättigbar, was zu einem “Hook-Effekt” führte. Der Durchsatz- und Reagenzienbedarf für SPR, BLI und ITC wurde evaluiert und allgemeine Empfehlungen für deren Anwendung auf PROTAC-Projekte gegeben.

Introduction

Die Polyubiquitinierung von Proteinen in der Zelle ist ein streng regulierter Prozess, an dem Enzyme der Ubiquitin-Ligase-Familie beteiligt sind ^1,2. Die terminalen Enzyme im Signalweg sind die E3-Ubiquitin-Ligasen, die Ubiquitin-Moleküle kovalent an ihre Proteinbindungspartner binden³. Die Polyubiquitinierung dieser Proteinbindungspartner zielt auf den proteolytischen Abbau durch das Proteasom⁴ ab. Dieses System ist Teil des Proteinhomöostase-Prozesses, der therapeutisch genutzt wurde, um den Abbau von Proteinen zu induzieren, die an der Krankheit beteiligt sind⁵. Kleine Moleküle, die die Wechselwirkung zwischen E3-Ubiquitin-Ligasen induzieren, wie z. B. die Von-Hippel-Lindau-E3-Ligase (VHL) oder Cereblon (CRBN), bestehen typischerweise aus einem E3-Ligase-bindenden Gefechtskopf, der durch einen flexiblen Linker mit einem Gefechtskopf verbunden ist, der an das Protein bindet, das für den Abbau anvisiert wird. Diese heterobifunktionellen Moleküle werden allgemein als Proteolyse bezeichnet, die auf Chimären abzielt, oder PROTACS⁶.

Bei der Entwicklung von PROTACS wird die Fähigkeit von Molekülen untersucht, den Abbau von Proteinen in Zellen zu induzieren. Es wurden viele zelluläre Assay-Systeme entwickelt, die die induzierte Interaktion zwischen dem Zielprotein und E3-Ligase-Komponenten, wie VHL oder CRBN, bei der Behandlung der Zellen mit einem PROTAC-Molekül überwachen. Ein solcher zellulärer Assay, das nanoluc-Halotag-System⁷, beinhaltet eine E3-Ligase, die mit dem Halotag-Akzeptor fusioniert ist, und ein Zielprotein, das mit einem nanoluc-Donor markiert ist. Die ternäre Komplexbildung bringt den Nanoluc-Donor und den Halotag-Akzeptor in die Nähe und ermöglicht die Energieübertragung vom Donor zum Akzeptor, was zur Emission von Licht führt. Variationen dieses Systems können verwendet werden, um die zelluläre Permeabilität von PROTACS-Molekülen⁸ oder Änderungen des relativen Niveaus der Ubiquitinierung des Zielproteins⁹ zu bewerten. Während diese zellulären Systeme für die Optimierung von PROTACs unerlässlich sind, ist die Bildung von Komplexen zwischen E3-Ligasen und Proteinen, die für den Abbau bestimmt sind, ein mehrstufiger Prozess^10,11. Die Kinetik und Thermodynamik der beteiligten binären und ternären Wechselwirkungen tragen zur effizienten Ubiquitinierung und dem daraus resultierenden Abbau des Proteins^12,13,14 bei.

Darin werden Protokolle beschrieben, die für die biophysikalische Charakterisierung der durch PROTACS induzierten ternären Komplexbildung unter Verwendung von Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Bioschichtinterferometrie (BLI) und isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) angepasst werden können. SPR- und ITC-Protokolle für das MZ1 PROTAC-Molekül, das die Bildung ternärer Komplexe zwischen Brd4,^BD2 und VHL induziert, die aus den Literaturberichten^13,15 abgeleitet und hier beschrieben wurden, waren in der Lage, die berichteten Ergebnisse mit einigen Modifikationen der berichteten Verfahren zu rekapitulieren^, die diskutiert werden. Dieser Bericht enthält eine Beschreibung eines BLI-Assays, der zur Bewertung der ternären Komplexbildung zwischen MZI, Brd4^BD2 und VHL verwendet wird. Die Affinitätsmessungen von BLI stimmten mit denen überein, die in SPR und ITC beobachtet wurden. Ein zuvor veröffentlichtes Protokoll, in dem ein SPR-Assay zur Bewertung der PROTAC-induzierten ternären Komplexbildung zwischen PPM1D, einer Ser/Thr-Proteinphosphatase, deren Expression p53-abhängig induziert wird,¹⁶, und CRBN entwickelt wurde, wird ebenfalls beschrieben. In diesem Fall hat das PROTAC-Molekül eine nanomolare Affinität zu PPM1D, aber nur eine mikromolare Affinität zu CRBN. In diesem Fall ist die Bindung des PROTAC-Moleküls an CRBN nicht sättigbar, was zu dem häufig beobachteten “Hook-Effekt” führt. Der Hook-Effekt ist eine Eigenschaft von drei Körpersystemen, in denen es zwei Spezies gibt, die einen heterotrimeren Komplex bilden können, wenn beide an ein Brückenmolekül gebunden sind (Abbildung 1)¹⁷. Der Hakeneffekt wird beobachtet, wenn die brückenbildende Spezies im Vergleich zu den beiden anderen Spezies eine Überkonzentration aufweist. Der resultierende Zustand ist einer, in dem die binären Wechselwirkungen die ternären Wechselwirkungen übertreffen. Die Systeme, bei denen der Hakeneffekt beobachtet wird, erfordern spezifische Überlegungen zur Versuchsplanung, die in diesem Bericht erörtert werden. Es werden allgemeine Konzepte und Reagenzienanforderungen für die Evaluierung des Einsatzes biophysikalischer Assays zur Bewertung der Bildung von PROTAC-induzierten ternären Komplexen bereitgestellt.

Protocol

Alle Proteine wurden in E. coli mit guter Ausbeute und Reinheit (>80%) gemäß den Literaturprotokollen überexprimiert18. Die Biotinylierung wurde mit Hilfe einer BirA-katalysierten Reaktion18 durchgeführt. Alle kleinen Moleküle wurden in 1 mM Stammlösungen in 100% DMSO hergestellt. Die hier beschriebenen Verfahren erfordern keine spezielle Laborsicherheitsausrüstung oder Vorsichtsmaßnahmen. Es sollte Standard-Labor-Schutzausrüstung (PSA) verwendet werden (d…

Representative Results

Die Charakterisierung des binären VHL:MZ1-Komplexes und des ternären VHL:MZ1:Brd4-BD2-Komplexes ist in Abbildung 2 (ITC), Abbildung 3 (BLI) und Abbildung 4 (SPR) unter Verwendung eines sehr ähnlichen Puffers zu finden. Die aus orthogonalen Assays extrahiertenK-D-Werte sind konsistent. Die Kooperativität kann durch K D (binär) / KD (ternär) berechnet werden, was sehr positiv ist (15 v…

Discussion

Die biophysikalische Charakterisierung der binären und ternären Wechselwirkungen zwischen PROTAC-Molekülen und ihren Proteinbindungspartnern kann einzigartige und komplementäre Einblicke in weit verbreitete zelluläre Systeme liefern. Das Verständnis der Affinität zwischen den einzelnen Sprengköpfen eines PROTAC-Moleküls und seinen Proteinbindungspartnern kann dazu beitragen, die Bemühungen der medizinischen Chemie zur Optimierung dieser Wechselwirkungen zu lenken. Zuvor veröffentlichte Kristallstrukturen tern?…

Materials

96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments