Utvikling og anvendelse av biofysiske analyser for evaluering av ternær kompleksdannelse indusert av proteolyse rettet mot kimærer (PROTACS)

Summary

Her beskriver vi protokoller for biofysisk karakterisering av ternær kompleksdannelse indusert av proteolyse rettet mot kimærer (PROTACS) som involverer ubiquitinligasene Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) og Cereblon (CRBN). Biofysiske metoder illustrert her inkluderer overflateplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC).

Abstract

E3-ligaser og proteiner målrettet for nedbrytning kan induseres til å danne komplekser av heterobifunksjonelle molekyler i en flertrinnsprosess. Kinetikken og termodynamikken til de involverte interaksjonene bidrar til effektiviteten av ubiquitinering og resulterende nedbrytning av proteinet. Biofysiske teknikker som overflateplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) gir verdifull informasjon som kan brukes til optimalisering av disse interaksjonene. Ved hjelp av to modellsystemer ble det etablert et biofysisk analyseverktøy for å forstå kooperativiteten til ternær kompleksdannelse og virkningen av “krokeffekten” på bindingskinetikken. I ett tilfelle ble en proteolyse rettet mot kimærer (PROTAC) molekyl som induserte ternær kompleksdannelse mellom Brd4^BD2 og VHL evaluert. Det heterobifunksjonelle molekylet, MZ1, har nM-affiniteter for både Brd4^{BD2-proteinet} (SPR K D = 1 NM, ITC K D = 4 nM) og VHL-komplekset (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). For dette systemet ble det utviklet robuste SPR-, BLI- og ITC-analyser som reproduserte publiserte resultater som demonstrerte kooperativiteten til ternær kompleksdannelse. I det andre tilfellet ble et molekyl som induserte ternære komplekser mellom et 46,0 kDa protein, PPM1D og cereblon [CRBN (319-442)] studert. Det heterobifunksjonelle molekylet, BRD-5110, har en SPR_K D = 1 nM for PPM1D, men mye svakere binding mot det avkortede CRBN (319-442) komplekset (SPR K_D = ~ 3 μM). I så fall var bindingen for CRBN i SPR ikke mettet, noe som resulterte i en “krokeffekt”. Gjennomstrømnings- og reagenskrav for SPR, BLI og ITC ble evaluert, og generelle anbefalinger for deres anvendelse på PROTAC-prosjekter ble gitt.

Introduction

Polyubiquitinering av proteiner i cellen er en tett regulert prosess som involverer enzymer i Ubiquitin Ligase-familien ^1,2. De terminale enzymene i banen er E3 ubiquitin-ligasene som kovalent fester ubiquitinmolekyler til deres proteinbindende partnere³. Polyubiquitinering av disse proteinbindende partnerne retter seg mot dem for proteolytisk nedbrytning av proteasomet⁴. Dette systemet er en del av proteinhomeostaseprosessen som har blitt terapeutisk utnyttet for å indusere nedbrytning av proteiner involvert i sykdom⁵. Små molekyler som induserer samspillet mellom E3 ubiquitin ligaser, slik som Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) eller cereblon (CRBN), er vanligvis sammensatt av et E3 ligasebindende stridshode forbundet med en fleksibel linker til et stridshode som binder seg til proteinet som er målrettet for nedbrytning. Disse heterobifunksjonelle molekylene blir ofte referert til som proteolyse rettet mot kimærer eller PROTACS⁶.

Utviklingen av PROTACS innebærer å evaluere molekylers evne til å indusere nedbrytning av proteiner i celler. Mange cellulære analysesystemer er utviklet som overvåker den induserte interaksjonen mellom målproteinet og E3-ligasekomponentene, slik som VHL eller CRBN, ved behandling av cellene med et PROTAC-molekyl. En slik cellulær analyse, nanoluc-Halotag-systemet⁷, involverer en E3-ligase smeltet til Halotag-akseptoren og et målprotein merket med en nanoluc-donor. Ternær kompleksdannelse bringer nanoluc-donoren og Halotag-akseptoren i nærheten, noe som tillater overføring av energi fra giveren til akseptoren, noe som resulterer i utslipp av lys. Variasjoner av dette systemet kan brukes til å vurdere den cellulære permeabiliteten til PROTACS-molekyler⁸ eller endringer i det relative nivået av målprotein ubiquitinering⁹. Selv om disse cellulære systemene er avgjørende for å drive optimaliseringen av PROTACS, er dannelsen av komplekser mellom E3-ligaser og proteiner målrettet for nedbrytning en flertrinnsprosess^10,11. Kinetikken og termodynamikken til de involverte binære og ternære interaksjonene bidrar til effektivitet ubiquitinering og resulterende nedbrytning av proteinet^12,13,14.

Her beskrives protokoller som kan tilpasses for biofysisk karakterisering av ternær kompleksdannelse indusert av PROTACS ved bruk av overflateplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). SPR og ITC protokoller for MZ1 PROTAC molekylet som induserer ternær kompleksdannelse mellom Brd4^BD2 og VHL avledet fra litteratur rapporter^13,15 og beskrevet her var i stand til å rekapitulere de rapporterte resultatene med noen modifikasjoner av de rapporterte prosedyrene^, som vil bli diskutert. En beskrivelse av en BLI-analyse brukt til å evaluere ternær kompleksdannelse mellom MZI, Brd4^BD2 og VHL er inkludert i denne rapporten. Affinitetsmålinger fra BLI var konsistente med de som ble observert i SPR og ITC. En tidligere publisert protokoll der en SPR-analyse ble utviklet for å vurdere den PROTAC-induserte ternære kompleksdannelsen mellom PPM1D, en Ser / Thr proteinfosfatase hvis uttrykk er indusert på en p53-avhengig måte¹⁶, og CRBN er også beskrevet. I dette tilfellet har PROTAC-molekylet en nanomolar affinitet for PPM1D, men bare en mikromolar affinitet for CRBN. I dette tilfellet er bindingen av PROTAC-molekylet til CRBN ikke mettet, noe som resulterer i den ofte observerte “krokeffekten”. Krokeffekten er en egenskap ved tre kroppssystemer der det er to arter som kan danne et heterotrimerisk kompleks når begge er bundet til et bromolekyl (figur 1)¹⁷. Krokeffekten observeres når broarten er i overkonsentrasjon i forhold til de to andre artene. Den resulterende tilstanden er en der de binære interaksjonene utkonkurrerer de ternære interaksjonene. Systemene der krokeffekten observeres krever spesifikke eksperimentelle designhensyn som diskuteres i denne rapporten. Generelle konsepter og reagenskrav for evaluering av bruken av biofysiske analyser for evaluering av PROTAC-indusert ternær kompleksdannelse er gitt.

Protocol

Alle proteinene ble overuttrykt i E.coli med godt utbytte og renhet (>80%) etter litteraturprotokollene18. Biotinylering ble utført ved hjelp av en BirA-katalysert reaksjon18. Alle små molekyler ble fremstilt ved 1 mM stamløsninger i 100% DMSO. Prosedyrene beskrevet her krever ikke spesialisert laboratoriesikkerhetsutstyr eller forholdsregler. Standard personlig verneutstyr for laboratorier (PPE) skal brukes (dvs. laboratoriefrakk, vernebriller og hansker). …

Representative Results

Karakterisering av VHL: MZ1 binært kompleks og VHL: MZ1: Brd4BD2 ternært kompleks finnes i figur 2 (ITC), figur 3 (BLI) og figur 4 (SPR) ved hjelp av en veldig lik buffer. KD ekstrahert fra ortogonale analyser er konsistent. Kooperativiteten kan beregnes med K D (binær) / KD (ternær), som er svært positiv (15 fra ITC eller 26 fra SPR). Karakterisering av CR…

Discussion

Biofysisk karakterisering av binære og ternære interaksjoner mellom PROTAC-molekyler og deres proteinbindende partnere kan gi unik og komplementær innsikt i forhold til mye brukte cellulære systemer. Å forstå affiniteten mellom hvert stridshode i et PROTAC-molekyl og dets proteinbindende partnere kan bidra til å veilede medisinsk kjemiinnsats mot optimalisering av disse interaksjonene. Tidligere publiserte krystallstrukturer av ternære PROTAC-komplekser har avslørt at atomer i linkerregionen kan danne interaksjo…

Materials

96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments