Разработка и применение биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS)
Summary
В данной работе мы описываем протоколы биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS), в которых участвуют убиквитин-лигазы фон Хиппеля-Линдау E3-лигазы (VHL) и цереблона (CRBN). Биофизические методы, проиллюстрированные здесь, включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойную интерферометрию (BLI) и изотермическую титрованную калориметрию (ITC).
Abstract
Е3-лигазы и белки, предназначенные для деградации, могут быть индуцированы для образования комплексов гетеробифункциональными молекулами в многоступенчатом процессе. Кинетика и термодинамика взаимодействий способствуют эффективности убиквитинирования и, как следствие, деградации белка. Биофизические методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойная интерферометрия (BLI) и изотермическая титровательная калориметрия (ITC), предоставляют ценную информацию, которую можно использовать для оптимизации этих взаимодействий. С помощью двух модельных систем был создан биофизический инструментарий для понимания кооперативности формирования тройных комплексов и влияния «эффекта крюка» на кинетику связывания. В одном случае был оценен протеолиз, нацеленный на молекулу химеры (PROTAC), которая индуцировала образование тройного комплекса между Brd4BD2 и VHL. Гетеробифункциональная молекула MZ1 обладает нМ сродством как к белку Brd4BD2 (SPR K D = 1 нМ, ITC K D = 4 нМ), так и к комплексу VHL (SPR K D = 29 нМ, ИТК K D = 66 нМ). Для этой системы были разработаны надежные анализы SPR, BLI и ITC, которые воспроизводили опубликованные результаты, демонстрирующие кооперативность образования тройных комплексов. В другом случае была изучена молекула, которая индуцировала тройные комплексы между белком PPM1D с молекулярной массой 46,0 кДа и цереблоном [CRBN (319-442)]. Гетеробифункциональная молекула BRD-5110 имеет SPR KD = 1 нМ для PPM1D, но гораздо более слабое связывание с усеченным комплексом CRBN (319-442) (SPR KD= ~ 3 мкМ). В этом случае связывание CRBN в SPR не насыщалось, что приводило к «хуковому эффекту». Была проведена оценка требований к пропускной способности и реагентам для SPR, BLI и ITC, а также даны общие рекомендации по их применению к проектам PROTAC.
Introduction
Полиубиквитинирование белков в клетке является жестко регулируемым процессом, в котором участвуют ферменты семейства убиквитин-лигаз 1,2. Концевыми ферментами в этом пути являются убиквитин-лигазы E3, которые ковалентно присоединяют молекулы убиквитина к своим белок-связывающим партнерам3. Полиубиквитинирование этих партнеров, связывающих белки, нацелено на их протеолитическую деградацию протеасомой4. Эта система является частью процесса белкового гомеостаза, который был терапевтически использован для индукции деградации белков, участвующих в заболевании5. Малые молекулы, которые индуцируют взаимодействие между убиквитин-лигазами E3, такие как E3-лигаза фон Хиппеля-Линдау (VHL) или церебблон (CRBN), обычно состоят из боеголовки, связывающей E3-лигазу, соединенной гибким линкером с боеголовкой, которая связывается с белком, предназначенным для деградации. Эти гетеробифункциональные молекулы обычно называют протеолизом, нацеленным на химеры, или PROTACS6.
Разработка PROTACS включает в себя оценку способности молекул индуцировать деградацию белков в клетках. Было разработано множество систем клеточного анализа, которые отслеживают индуцированное взаимодействие между белком-мишенью и компонентами E3-лигазы, такими как VHL или CRBN, при обработке клеток молекулой PROTAC. Один из таких клеточных анализов, система nanoluc-Halotag7, включает в себя E3-лигазу, сплавленную с акцептором Halotag, и белок-мишень, помеченный донором нанолюка. Образование тройного комплекса сближает донор нанолюка и акцептор галотага, что позволяет передавать энергию от донора к акцептору, что приводит к излучению света. Вариации этой системы могут быть использованы для оценки клеточной проницаемости молекул PROTACS8 или изменения относительного уровня убиквитинирования целевого белка9. В то время как эти клеточные системы необходимы для оптимизации PROTACS, образование комплексов между E3-лигазами и белками, предназначенными для деградации, является многоступенчатымпроцессом. Кинетика и термодинамика бинарных и троичных взаимодействий способствуют эффективному убиквитинированию и, как следствие, деградации белка12,13,14.
Описаны протоколы, которые могут быть адаптированы для биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных PROTACS, с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), биослойной интерферометрии (BLI) и изотермической титрующей калориметрии (ITC). Протоколы SPR и ITC для молекулы MZ1 PROTAC, которая индуцирует образование тройных комплексов между Brd4BD2 и VHL, полученные из литературных сообщений13,15 и описанные здесь, позволили повторить полученные результаты с некоторой модификацией описанных процедур, которые будут обсуждаться. В настоящий отчет включено описание анализа BLI, используемого для оценки образования тройного комплекса между MZI, Brd4,BD2 и VHL. Измерения сродства с помощью BLI согласуются с теми, которые наблюдались в SPR и ITC. Также описан ранее опубликованный протокол, в котором был разработан SPR-анализ для оценки образования тройного комплекса, индуцированного PROTAC, между PPM1D, протеинфосфатазой Ser/Thr, экспрессия которой индуцируется p53-зависимым образом16, и CRBN. В этом случае молекула PROTAC имеет наномолярное сродство к PPM1D и только микромолярное сродство к CRBN. В этом случае связывание молекулы PROTAC с CRBN не является насыщаемым, что приводит к часто наблюдаемому «эффекту крюка». Крюковый эффект является свойством трех систем организма, в которых есть два вида, которые могут образовывать гетеротримерный комплекс, когда оба связаны с молекулой-мостом (рис. 1)17. Эффект крючка наблюдается, когда перемычка находится в избыточной концентрации по сравнению с двумя другими видами. Результирующее состояние — это состояние, в котором бинарные взаимодействия вытесняют троичные взаимодействия. Системы, в которых наблюдается эффект крюка, требуют специальных соображений по планированию экспериментов, обсуждаемых в этом отчете. Приведены общие понятия и требования к реагентам для оценки использования биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных PROTAC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Биофизическая характеристика бинарных и троичных взаимодействий между молекулами PROTAC и их партнерами по связыванию с белками может дать уникальную и дополняющую информацию о широко используемых клеточных системах. Понимание сродства между каждой боеголовкой молекулы PROTAC и ее партн?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана премией за инновации и развитие технологий от Центра развития терапии при Институте Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда. Авторы хотели бы поблагодарить членов высшего руководства и комитет по рассмотрению за поддержку этой работы.
Materials
| 96-plate | Greiner | 655076 | flat-bottom, black plates used In BLI experiments |
| 96-well plate | Nunc | 73520-120 | Plate use for ITC sample preparation |
| 96-well plate | Greiner | 650101 | Plate used to prepare samples for SPR experiments |
| Auto iTC200 micro-calorimeter | Malvern Panalytical | Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued. | |
| Biacore S200 | Cytiva | 29136649 | Instrument used to perform SPR experiments |
| MZ1 | ProbeChem | PC-60099 | PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2 |
| NTA sensor chip | Cytiva | BR100532 | SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D |
| Octet Red-384 | Sartorius | Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued. | |
| Plate cover | Malvern | PQA0001 | Cover for Nunc 96-well plate (73520-120) |
| Plate cover | Cytiva | 28975816 | Plate cover for Greiner plate (650101) |
| Series S SA sensor chip | Cytiva | BR100531 | SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4 |
| Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors | Sartorius | 18-509 | Coated sensors used in BLI experiments |
Referências
- Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
- Song, L., Luo, Z. -. Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
- Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
- Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
- Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic – a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
- Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
- Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
- Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
- Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
- Paiva, S. -. L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
- Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
- Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
- Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
- Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
- Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
- Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).
