Utveckling och tillämpning av biofysikaliska analyser för att utvärdera ternära komplex inducerad av proteolysriktade chimärer (PROTACS)

Summary

Här beskriver vi protokoll för biofysikalisk karakterisering av ternära komplexbildning inducerad av proteolysriktade chimärer (PROTACS) som involverar ubiquitinligaserna Von Hippel-Lindau E3-ligas (VHL) och Cereblon (CRBN). Biofysikaliska metoder som illustreras här inkluderar ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isotermisk titreringskalorimetri (ITC).

Abstract

E3-ligaser och proteiner som är avsedda för nedbrytning kan induceras att bilda komplex av heterobifunktionella molekyler i en flerstegsprocess. Kinetiken och termodynamiken i de inblandade interaktionerna bidrar till effektiviteten av ubiquitinering och resulterande nedbrytning av proteinet. Biofysikaliska tekniker som ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isotermisk titreringskalorimetri (ITC) ger värdefull information som kan användas för att optimera dessa interaktioner. Med hjälp av två modellsystem etablerades en biofysikalisk analysverktygslåda för att förstå kooperativiteten hos ternära komplex och effekten av “krokeffekten” på bindningskinetiken. I ett fall utvärderades en proteolysriktad chimärmolekyl (PROTAC) som inducerade ternära komplexbildning mellan Brd4^BD2 och VHL. Den heterobifunktionella molekylen, MZ1, har nM-affiniteter för både Brd4^{BD2-proteinet} (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) och VHL-komplexet (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). För detta system utvecklades robusta SPR-, BLI- och ITC-analyser som reproducerade publicerade resultat som visade kooperativiteten hos ternära komplexbildning. I det andra fallet studerades en molekyl som inducerade ternära komplex mellan ett 46,0 kDa-protein, PPM1D, och cereblon [CRBN (319-442)]. Den heterobifunktionella molekylen, BRD-5110, har en SPR K D = 1 nM för PPM1D men mycket svagare bindning mot det trunkerade CRBN-komplexet (319-442) (SPR K_D= ~ 3 μM). I det fallet var bindningen för CRBN i SPR inte mättnadsbar, vilket resulterade i en “hook-effekt”. Genomströmnings- och reagenskrav för SPR, BLI och ITC utvärderades, och allmänna rekommendationer för deras tillämpning på PROTAC-projekt tillhandahölls.

Introduction

Polyubiquitinering av proteiner i cellen är en hårt reglerad process som involverar enzymer i Ubiquitin-ligasfamiljen ^1,2. De terminala enzymerna i vägen är E3 ubiquitin-ligaser som kovalent binder ubiquitinmolekyler till sina proteinbindande partners³. Polyubiquitineringen av dessa proteinbindande partners riktar sig mot dem för proteolytisk nedbrytning av proteasom⁴. Detta system är en del av proteinhomeostasprocessen som har utnyttjats terapeutiskt för att inducera nedbrytningen av proteiner som är involverade i sjukdom⁵. Små molekyler som inducerar interaktionen mellan E3 ubiquitin-ligaser, såsom Von Hippel-Lindau E3-ligas (VHL) eller cereblon (CRBN), består vanligtvis av en E3-ligasbindande stridsspets ansluten med en flexibel länkare till en stridsspets som binder till proteinet som är föremål för nedbrytning. Dessa heterobifunktionella molekyler kallas vanligen proteolysriktade chimärer eller PROTACS⁶.

Utvecklingen av PROTACS innebär att man utvärderar molekylers förmåga att inducera nedbrytning av proteiner i celler. Många cellulära analyssystem har utvecklats som övervakar den inducerade interaktionen mellan målproteinet och E3-ligaskomponenter, såsom VHL eller CRBN, vid behandling av cellerna med en PROTAC-molekyl. En sådan cellulär analys, nanoluc-Halotag-system⁷, involverar ett E3-ligas som smälts samman med Halotag-acceptorn och ett målprotein som är märkt med en nanoluc-donator. Ternära komplexbildning för nanolucdonatorn och Halotag-acceptorn i närheten, vilket möjliggör överföring av energi från givaren till acceptorn, vilket resulterar i utsläpp av ljus. Variationer av detta system kan användas för att bedöma den cellulära permeabiliteten hos PROTACS-molekyler⁸ eller förändringar i den relativa nivån av målproteinubiquitinering⁹. Även om dessa cellulära system är viktiga för att driva optimeringen av PROTACS, är bildandet av komplex mellan E3-ligaser och proteiner som är avsedda för nedbrytning en flerstegsprocess^10,11. Kinetiken och termodynamiken för de binära och ternära interaktioner som är involverade bidrar till effektivitetubiquitinering och resulterande nedbrytning av proteinet^12,13,14.

Här beskrivs protokoll som kan anpassas för biofysikalisk karakterisering av ternära komplexbildning inducerad av PROTACS med hjälp av ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isoterm titreringskalorimetri (ITC). SPR- och ITC-protokoll för MZ1 PROTAC-molekylen som inducerar ternära komplexbildning mellan Brd4^BD2 och VHL härledda från litteraturrapporter^13,15 och som beskrivs här kunde rekapitulera de rapporterade resultaten med viss modifiering av de rapporterade procedurerna^, vilket kommer att diskuteras. En beskrivning av en BLI-analys som används för att utvärdera ternära komplex bildning mellan MZI, Brd4^BD2 och VHL ingår i denna rapport. Affinitetsmätningar från BLI överensstämde med de som observerades i SPR och ITC. Ett tidigare publicerat protokoll där en SPR-analys utvecklades för att bedöma den PROTAC-inducerade ternära komplexbildningen mellan PPM1D, ett Ser/Thr-proteinfosfatas vars uttryck induceras på ett p53-beroende sätt¹⁶, och CRBN beskrivs också. I detta fall har PROTAC-molekylen en nanomolär affinitet för PPM1D men endast en mikromolär affinitet för CRBN. I detta fall är bindningen av PROTAC-molekylen till CRBN inte mättnadsbar, vilket resulterar i den allmänt observerade “krokeffekten”. Krokeffekten är en egenskap hos tre kroppssystem där det finns två arter som kan bilda ett heterotrimert komplex när båda är bundna till en överbryggande molekyl (Figur 1)¹⁷. Krokeffekten observeras när den överbryggande arten är i överkoncentration i förhållande till de två andra arterna. Det resulterande tillståndet är ett tillstånd där de binära interaktionerna konkurrerar ut de ternära interaktionerna. De system där krokeffekten observeras kräver specifika experimentella designöverväganden som diskuteras i denna rapport. Allmänna begrepp och reagenskrav för utvärdering av användningen av biofysikaliska analyser för utvärdering av PROTAC-inducerad ternära komplexbildning tillhandahålls.

Protocol

Alla proteiner överuttrycktes i E.coli med god avkastning och renhet (>80%) enligt litteraturprotokollen18. Biotinylering utfördes med hjälp av en BirA-katalyserad reaktion18. Alla små molekyler framställdes vid 1 mM stamlösningar i 100% DMSO. De procedurer som beskrivs här kräver inte specialiserad laboratoriesäkerhetsutrustning eller försiktighetsåtgärder. Standardutrustning för laboratoriets personliga skyddsutrustning (PPE) bör användas (dvs. lab…

Representative Results

Karakterisering av VHL: MZ1 binärt komplex och VHL: MZ1: Brd4BD2 ternära komplex finns i figur 2 (ITC), figur 3 (BLI) och figur 4 (SPR) med en mycket liknande buffert. KD extraherad från ortogonala analyser är konsekvent. Kooperativiteten kan beräknas med K D (binär) / KD (ternär), som är mycket positiv (15 från ITC eller 26 från SPR). Karakterisering …

Discussion

Biofysikalisk karakterisering av de binära och ternära interaktionerna mellan PROTAC-molekyler och deras proteinbindande partners kan ge unika och kompletterande insikter i förhållande till allmänt använda cellulära system. Att förstå affiniteten mellan varje stridsspets i en PROTAC-molekyl och dess proteinbindande partners kan hjälpa till att vägleda läkemedelskemiska ansträngningar mot optimering av dessa interaktioner. Tidigare publicerade kristallstrukturer av ternära PROTAC-komplex har avslöjat att at…

Materials

96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments