मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों से इम्यूनोफेनोटाइप्ड मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की एकल-कोशिका छंटाई
Summary
यह प्रोटोकॉल एकल-सेल सॉर्टिंग विधि का उपयोग करके मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के उपयोग का वर्णन करता है। विशेष रूप से, एकल-सेल सॉर्टिंग का उपयोग एक विषम आबादी से इम्यूनोफेनोटाइपकोशिकाओं की 99% शुद्धता प्राप्त कर सकता है जब एक मल्टीपैरामीट्रिक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जाता है।
Abstract
एक जीव के मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) में शरीर में वयस्क कोशिकाओं के कई वंशों में अंतर करने की असाधारण क्षमता होती है और वे अपने इम्यूनोमॉड्यूलेटरी और विरोधी भड़काऊ गुणों के लिए जाने जाते हैं। इन स्टेम कोशिकाओं का उपयोग पुनर्योजी जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए एक वरदान है, लेकिन साथ ही, उनके साथ जुड़े कई सेलुलर अस्पष्टताओं के कारण पुनर्योजी चिकित्सा और चिकित्सीय के लिए एक अभिशाप है। ये अस्पष्टताएं इन स्टेम कोशिकाओं के स्रोत में विविधता और उनकी इन विट्रो विकास स्थितियों से उत्पन्न हो सकती हैं, जिनमें से दोनों उनकी कार्यात्मक विषमता को दर्शाती हैं।
यह चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए एमएससी की शुद्ध, सजातीय आबादी प्रदान करने के तरीकों की गारंटी देता है। फ्लो साइटोमेट्री के क्षेत्र में प्रगति ने एक मल्टीपैरामीट्रिक दृष्टिकोण का उपयोग करके एकल-कोशिका आबादी का पता लगाने में सक्षम बनाया है। यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति-सहायता प्राप्त एकल-कोशिका छंटाई के माध्यम से मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों (एसएचईडी) से स्टेम कोशिकाओं की पहचान और शुद्धिकरण करने का एक तरीका बताता है। सतह मार्करों की एक साथ अभिव्यक्ति, अर्थात्, सीडी 90-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी), सीडी 73-पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन (पेरसीपी-साइ 5.5), सीडी 105-एलोफिकोसाइनिन (एपीसी), और सीडी 44-वी 450 ने मल्टीपैरामीट्रिक फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एमएससी के “उज्ज्वल”, सकारात्मक-एक्सप्रेसर्स की पहचान की। हालांकि, इन सकारात्मक मार्करों के चौगुनी अभिव्यक्तियों के प्रतिशत में 7 वें मार्ग से बाद के अंशों तक एक महत्वपूर्ण गिरावट देखी गई।
इम्यूनोफेनोटाइप्ड उप-आबादी को एकल-सेल सॉर्ट मोड का उपयोग करके क्रमबद्ध किया गया था जहां केवल दो सकारात्मक और एक नकारात्मक मार्कर ने समावेश मानदंड का गठन किया था। इस पद्धति ने क्रमबद्ध आबादी की सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित की और छंटाई के बाद सेल प्रसार को बनाए रखा। इस तरह की छंटाई के लिए डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन का उपयोग गेटेड उप-आबादी के लिए वंश-विशिष्ट भेदभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। अलगाव की स्थिति में सुधार करने और कई सेल सतह मार्कर जानकारी प्राप्त करने के लिए इस दृष्टिकोण को अन्य एकल-सेल प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) को सेल-आधारित उपचारों के लिए उपयुक्त कोशिकाओं के एक स्केलेबल स्रोत के रूप में माना जा सकता है और इसे पुनर्योजी चिकित्सा में स्वर्ण मानक प्रणाली माना जा सकता है। इन कोशिकाओं को विभिन्न ऊतक उत्पत्ति के साथ शरीर में विभिन्न स्रोतों से अलग किया जासकता है। उनके स्रोत ऊतक के आधार पर, प्रत्येक प्रकार का एमएससी एक अस्पष्ट इन विट्रो व्यवहारप्रदर्शित करता है। यह उनके रूपात्मक औरकार्यात्मक गुणों में अच्छी तरह से देखा जाता है। कई अध्ययनों ने आयामों में इंट्रा-क्लोनल भिन्नता दिखाई है, जिसमें वयस्क ऊतक भेदभाव, जीनोमिक स्थिति और एमएससी 2,4 के चयापचय और सेलुलर वास्तुकला शामिल हैं।
कोशिकाओं की इम्यूनोफेनोटाइपिंग स्टेम कोशिकाओं की पहचान के लिए फ्लो साइटोमेट्री का एक सामान्य अनुप्रयोग रहा है और इसका उपयोग 2006 में इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेल एंड जीन थेरेपी (आईएससीटी) द्वारा एमएससी के रूप में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए न्यूनतम मानदंडों की एक सूची निर्धारित करने के लिए किया गया था। इसमें कहा गया है कि प्लास्टिक पालन और विट्रो में तीन वंशों (ओस्टोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और एडिपोजेनिक) में अंतर करने की क्षमता के साथ, ≥95% सेल आबादी को सीडी 105, सीडी 73, सीडी 90 व्यक्त करना चाहिए, और इन कोशिकाओं में सीडी 34, सीडी 45, सीडी 11 बी, सीडी 14 और एचएलए-डीआर की अभिव्यक्ति (≤2% सकारात्मक) की कमी होनी चाहिए, जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री5 द्वारा मापा जाता है।. यद्यपि एमएससी को आईएससीटी के न्यूनतम मानदंडों के तहत बायोमाकर्स के एक सेट द्वारा परिभाषित किया गया था, लेकिन उनके प्रतिरक्षा गुणों को इन बायोमाकर्स के साथ बेंचमार्क नहीं किया जा सकता था और क्रॉस-स्टडी तुलना और क्लोनल विविधताओंको निर्धारित करना आसान बनाने के लिए इन मानदंडों से परे अधिक की आवश्यकता थी।
आईएससीटी द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के बावजूद, एमएससी पर व्यापक शोध से पता चला है कि इस आबादी में विषमता मौजूद है, जो कई कारकों के कारण उत्पन्न हो सकती है, मुख्य रूप से एमएससी दाताओं6, ऊतक स्रोत7, क्लोनल आबादी के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं8, और संस्कृति की स्थिति2,9 के बीच उत्पन्न होने वाली विषमता की सर्वव्यापी प्रकृति के कारण, 10. गुणवत्ता और सेल भाग्य सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न ऊतक स्रोतों से इन प्राथमिक कोशिकाओं का लक्षण वर्णन और शुद्धि उनके उत्पादन में महत्वपूर्ण कदम हैं। जनसंख्या के बीच प्रदर्शित भिन्नताओं को समझने की आवश्यकता के लिए इसे उप-आबादी में हल करने के लिए एक कुशल विधि की आवश्यकता होती है जिसे विभाजित किया जा सकता है और अलग से एकत्र किया जा सकताहै। एकल-कोशिका स्तर विश्लेषण सेल-सेल भिन्नता की चुनौतियों को दूर करने में मदद करते हैं, विषम आबादी से उत्पन्न जैविक शोर को कम करते हैं, औरदुर्लभ कोशिकाओं की जांच और विशेषता की क्षमता प्रदान करते हैं।
उद्देश्य और चुने हुए मापदंडों के आधार पर, चयनित आबादी को क्रमबद्ध और समृद्ध करने के लिए कई तरीकों को नियोजित किया जा सकता है। सेल-सॉर्टिंग तकनीकों में थोक सॉर्टिंग और सिंगल-सेल सॉर्टिंग दोनों विधियां शामिल हो सकती हैं। जबकि थोक छंटाई चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) 13, फ्रैक्शनेशन 14, और एल्यूट्रिएशन15 के माध्यम से लक्षित आबादी को समृद्ध कर सकती है, एकल-सेल सॉर्टिंग प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 11 के माध्यम से अधिक सजातीय आबादी को समृद्ध कर सकती है। इन विधियों में से प्रत्येक का अपने फायदे और नुकसान के सेट के साथ तुलनात्मक विश्लेषण तालिका 1 में हाइलाइट किया गया है।
तालिका 1: विभिन्न तकनीकों का तुलनात्मक विश्लेषण: एमएसीएस, फ्रैक्शनेशन, एल्यूट्रिएशन और एफएसीएस उनके सिद्धांत में अंतर और किसी विशेष तकनीक को दूसरे पर चुनने के फायदे और नुकसान को उजागर करते हैं। संक्षेप: एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
तकनीक के आगमन के बाद से, एकल-कोशिका प्रवाह साइटोमेट्री ने एक विषम नमूना17 में एक विशिष्ट सेल आबादी की गणना16, पता लगाने और लक्षण वर्णन में एक प्रमुख भूमिका निभाई है। 2006 में हेविट एट अल ने विभेदित मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) 18 के समरूप पूल के अलगाव को बढ़ाने के लिए स्वचालित सेल सॉर्टिंग पद्धति की नींव रखी। एकल-कोशिका छंटाई ने जीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड एचईएससी की आबादी को आनुवंशिक रूप से संशोधित क्लोनों के अलगाव की सुविधा प्रदान की, जिसने नैदानिक अनुसंधान में एक नया आयाम खोला। सॉर्ट दक्षता में सुधार करने के लिए, आम तौर पर दो दृष्टिकोण लिए गए हैं; या तो क्रमबद्ध आबादी के संग्रह मीडिया को पोस्ट-सॉर्टेड सेल19 की व्यवहार्यता और प्रसार को बनाए रखने के लिए संशोधित किया जाता है या सेल-सॉर्टिंग एल्गोरिदम / सॉफ्टवेयर को उचित रूपसे संशोधित किया जाता है।
प्रौद्योगिकी की प्रगति के साथ, वाणिज्यिक प्रवाह साइटोमीटर और सेल सॉर्टर उन चुनौतियों का समाधान करने में मदद करने में सक्षम रहे हैं जो नाजुक और दुर्लभ सेल आबादी, विशेष रूप से विभिन्न मूल के स्टेम कोशिकाओं को सड़ने के दौरान पूरी हुई थीं। स्टेम सेल जीवविज्ञानियों की प्रमुख चुनौतियों में से एक जीन संपादनअध्ययन में आवश्यक अभिकर्मक प्रोटोकॉल के बाद मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का क्लोनल अलगाव रहा है। इसे एकल कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में सॉर्ट करके संबोधित किया गया था जो पूरक और वाणिज्यिक छोटे अणु रॉक अवरोधकों के साथ माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) के साथ लेपित थे। हालांकि, सेल अलगाव रणनीतियों को इंडेक्स सॉर्टिंग के उपयोग के साथ काफी हद तक परिष्कृत किया जा सकता है, सॉर्टिंग एल्गोरिदम की एक विशेषता जो अलग-अलग कोशिकाओं के इम्यूनोफेनोटाइप कीपहचान करती है। एकल-कोशिका छंटाई में इस परिष्कृत साधन ने न केवल स्टेम कोशिकाओं के लिए सॉर्ट दक्षता बढ़ाने में मदद की, विशेष रूप से दुर्लभ हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल आबादी के संबंध में, बल्कि कुशलतापूर्वक एकल-सेल क्लोन को उनके डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख20 से जोड़ा।
यह पेपर उप-आबादी के संवर्धन के लिए मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों (एसएचईडी) से इम्यूनोफेनोटाइप्ड स्टेम कोशिकाओं की एकल-कोशिका छंटाई पर केंद्रित है ताकि उनकी कार्यात्मक भेदभाव क्षमताओं का अध्ययन किया जा सके। दो एमएससी-पॉजिटिव मार्करों, सीडी 90 और सीडी 73 और एक नकारात्मक हेमटोपोइएटिक मार्कर सीडी 45 के संयोजन का उपयोग करते हुए, एमएससी को इम्यूनोफेनोटाइप किया गया था और मंद और शून्य एक्सप्रेसर की पहचान की गई थी। उनके इम्यूनोफेनोटाइप के आधार पर उप-आबादी को शुद्ध एमएससी, एकल सकारात्मक और दोहरी नकारात्मक आबादी के रूप में पहचाना गया था। उन्हें आगे के कार्यात्मक अध्ययनों के लिए शुद्ध और समृद्ध उप-आबादी प्राप्त करने के लिए एकल-सेल सॉर्ट मोड का उपयोग करके क्रमबद्ध किया गया था ताकि यह पता लगाया जा सके कि मार्करों की अंतर अभिव्यक्ति इन विट्रो कल्चर स्थितियों की एक कलाकृति थी या क्या इसका कार्यात्मक गुणों पर भी कोई प्रभाव पड़ता है। कोशिकाएं जो “सकारात्मक एमएससी मार्करों” के सजातीय एक्सप्रेसर नहीं थीं, उन्हें उनके कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए क्रमबद्ध किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में, प्रसवोत्तर स्रोतों के बीच, मौखिक ऊतक-व्युत्पन्न एमएससी ने अपने न्यूनतम नैतिक दायित्वों और उल्लेखनीय बहुवंशीयभेदभाव क्षमता के कारण गह?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा के उपयोग के लिए जवाहरलाल नेहरू सेंटर फॉर एडवांस्ड साइंटिफिक रिसर्च, बेंगलुरु, भारत में फ्लो सेल सुविधा को धन्यवाद देते हैं। विभेदित कोशिकाओं की पेलेट संस्कृति का क्रायो-सेक्शनिंग न्यूबर्ग आनंद संदर्भ प्रयोगशाला, बेंगलुरु, भारत में किया गया था। इस काम को मणिपाल एकेडमी ऑफ हायर एजुकेशन (एमएएचई), भारत से यूसी के इंट्राम्यूरल फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। एजी एमएएचई से डॉ टीएमए पाई छात्रवृत्ति के समर्थन के लिए आभारी है।
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
Referências
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