Kryopreservering og bioenergetisk evaluering av mononukleære celler fra humant perifert blod
Summary
Isolerte mononukleære celler i perifert blod kan brukes til analyse av immunfunksjoner og forstyrrelser, metabolske sykdommer eller mitokondrielle funksjoner. I dette arbeidet beskriver vi en standardisert metode for fremstilling av PBMC fra fullblod og påfølgende kryopreservering. Kryopreservering gjør denne tiden og stedet uavhengig.
Abstract
De fysiologiske funksjonene til eukaryote celler er avhengige av energi hovedsakelig levert av mitokondrier. Mitokondriell dysfunksjon er knyttet til metabolske sykdommer og aldring. Oksidativ fosforylering spiller en avgjørende rolle, da det er avgjørende for vedlikehold av energisk homeostase. PBMC har blitt identifisert som en minimalt invasiv prøve for å måle mitokondriell funksjon og har vist seg å gjenspeile sykdomsforhold. Måling av mitokondriell bioenergetisk funksjon kan imidlertid begrenses av flere faktorer i humane prøver. Begrensninger er mengden prøver som tas, prøvetakingstid, som ofte er spredt over flere dager, og steder. Kryopreservering av de innsamlede prøvene kan sikre konsistent innsamling og måling av prøver. Det må utvises forsiktighet for å sikre at de målte parametrene er sammenlignbare mellom kryopreserverte og nytilberedte celler. Her beskriver vi metoder for å isolere og kryopreservere PBMC fra humane blodprøver for å analysere mitokondrienes bioenergetiske funksjon i disse cellene. PBMC-kryopreservert i henhold til protokollen beskrevet her viser bare mindre forskjeller i cellenummer og levedyktighet, adenosintrifosfatnivåer og målt respiratorisk kjedeaktivitet sammenlignet med nyhøstede celler. Bare 8-24 ml humant blod er nødvendig for de beskrevne preparatene, noe som gjør det mulig å samle prøver under kliniske studier multisentralt og bestemme deres bioenergetikk på stedet.
Introduction
Humane perifere blodmononukleære celler (PBMC) brukes til ulike applikasjoner på mange vitenskapelige felt, inkludert studier av immunologiske og bioenergetiske problemstillinger, som de som er relatert til aldringsprosesser eller degenerative sykdommer 1,2. PBMC er heterogen i sammensetning og består av lymfocytter (B-celler, T-celler og NK-celler), monocytter og dendrittiske celler. Cellene viser noen ganger store individuelle forskjeller og variasjoner innen et emne, så standardiserte prosedyrer for håndtering av disse cellene er nødvendig. Viktige parametere som levedyktighet og renhet av isolasjonen er de grunnleggende kravene til håndtering og påvirkes i tillegg av miljøfaktorer som tidspunktet for innsamling, melatoninnivået, om motivet er fastende og andre 3,4.
Basert på studier av bioenergetikk av PBMC, beskriver vi her en metode for isolering, kryopreservering og dyrking av PBMC som også er egnet for andre metoder. Mens muskelbiopsi regnes som gullstandarden for mitokondriell energimetabolisme5, er undersøkelsen av blodceller en rask, minimalt invasiv prosedyre. I tillegg til dette tyder flere og flere studier på at endringene i mitokondriell funksjon i aldring og Alzheimers sykdom (AD) forekommer ikke bare i hjernen, men også i periferien 6,7,8,9,10. Metoden gjør det også mulig å undersøke andre tilstander og sykdommer, blant annet diabetes mellitus og fedme 11,12,13. Genuttrykksmønstre hos multippel sklerose-pasienter kan analyseres, eller immunfunksjon og påvirkning på det generelt 14,15,16.
PBMC er generelt avhengige av oksidativ fosforylering (OXPHOS) for å generere adenosintrifosfat (ATP)17,18. Derfor dekker PBMC et bredt spekter av applikasjoner som surrogater. I tidligere rapporter har energimetabolismen av PBMC blitt brukt til å behandle organdysfunksjoner, som ved tidlig hjertesvikt19, septisk sjokk20 eller kjønnsrelaterte forskjeller4 i mitokondriell funksjon. En generalisert metode for kryopreservering, isolering og dyrking av PBMC ville ha fordeler i sammenlignbarheten av resultater oppnådd ved forskjellige institutter. Det er stor variasjon i protokollene for hvert trinn21,22, målet med denne metoden er å gi en retningslinje for bioenergetiske målinger i PBMCs.
I denne artikkelen beskriver vi en metode for måling av bioenergetiske parametere i PBMC. Vi forklarer metodene for å isolere, kryopreservere og måle bioenergetikk av PBMC fra humant blod. Denne metoden kan brukes til å bestemme bioenergetiske parametere hos pasienter og evaluere dem i en klinisk sammenheng. For å bruke disse målingene trenger forskerne tilgang til en pasientpopulasjon som ferske blodprøver kan fås fra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gjør det mulig å isolere og kryopreservere mononukleære celler (PBMC) fra humant blod på en måte som er egnet for bioenergetiske analyser. Den beskrevne metoden gir mulighet til å isolere PBMC forsiktig og i store mengder, med høy levedyktighet og tilstrekkelige celler for bioenergetiske målinger. Det har den ulempen at selv med minimale avbrudd oppstår lange isolasjoner, men etterfølgende kryopreservering tillater en tidsuavhengig måling av bioenergetikk. Med denne metoden kan prøver samles…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker det kliniske teamet ved Universitetssykehuset Giessen-Marburg for blodinnsamlingen. Dette arbeidet ble finansiert av Justus Liebig-universitetet.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Referências
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologia. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
