Optogenetisk manipulation av signalvägar kan vara en kraftfull strategi för att undersöka hur signalering avkodas i utveckling, regenerering, homeostas och sjukdom. Detta protokoll ger praktiska riktlinjer för användning av ljus-syre-spänningsavkänningsdomänbaserade nodal- och benmorfogena proteiner (BMP) signalaktivatorer i det tidiga zebrafiskembryot.
Signalvägar orkestrerar grundläggande biologiska processer, inklusive utveckling, regenerering, homeostas och sjukdom. Metoder för att experimentellt manipulera signalering krävs för att förstå hur signalering tolkas i dessa vittomfattande sammanhang. Molekylära optogenetiska verktyg kan ge reversibla, avstämbara manipulationer av signalvägsaktivitet med en hög grad av spatiotemporal kontroll och har tillämpats in vitro, ex vivo och in vivo. Dessa verktyg kopplar ihop ljuskänsliga proteindomäner, såsom den homodimeriserande LOV-domänen (Blue Light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing), med signaleffektorer för att ge ljusberoende experimentell kontroll över signalering. Detta protokoll ger praktiska riktlinjer för användning av det LOV-baserade benmorfogenetiska proteinet (BMP) och nodalsignalaktivatorerna bOpto-BMP och bOpto-Nodal i det optiskt tillgängliga tidiga zebrafiskembryot. Den beskriver två kontrollexperiment: En snabb fenotypanalys för att bestämma lämpliga experimentella förhållanden och en immunofluorescensanalys för att direkt bedöma signalering. Tillsammans kan dessa kontrollexperiment bidra till att etablera en pipeline för användning av optogenetiska verktyg i tidiga zebrafiskembryon. Dessa strategier ger en kraftfull plattform för att undersöka signaleringens roll i utveckling, hälsa och fysiologi.
Signalvägar gör det möjligt för celler att reagera på sin omgivning och samordna aktiviteter på vävnads- och organismomfattande skalor. Signaler som är avgörande för embryonal utveckling är bland annat TGF-beta-superfamiljens medlemmar av benmorfogenetiskt protein (BMP) och nodal 1,2,3. Under embryogenesen formar de vägar som regleras av dessa och andra signaler kroppsplanen genom att kontrollera genuttryck och ytterligare processer för att säkerställa att olika vävnader och organ utvecklas och samverkar korrekt. Patologier, inklusive fosterskador och cancer, kan uppstå när signalering eller svar på signalering störs 4,5,6,7. Trots rigorösa undersökningar av signalering återstår mycket mer att upptäcka om hur nivåer och dynamik avkodas i en mängd olika sammanhang 8,9,10,11, särskilt under utveckling 12,13,14,15,16,17,18,19.
För att förstå hur signalering avkodas skulle ett idealiskt experiment vara att manipulera signaleringsnivåer, timing och/eller dynamik – med en hög grad av rumslig och tidsmässig kontroll – och bedöma resultat. Till exempel föreslås exakta rumsliga signalgradienter för att mönstra utvecklande vävnader20,21. Att ändra rumsliga fördelningar för signalgradient skulle hjälpa till att testa denna hypotes22. Dessutom blir betydelsen av signaldynamik för att generera olika cellulära svar tydligare: Samma signalväg kan instruera celler att differentiera eller föröka sig beroende på signaleringsfrekvens, till exempel 9,23. Experimentella paradigm där signaleringsdynamik lätt kan manipuleras kommer att vara värdefulla för att utforska förhållandet mellan dynamik och cellödesbeslut 8,12,13,14,15.
Historiskt sett har flera metoder använts för att manipulera signalering i utvecklingssammanhang, vilket har lett till grundläggande upptäckter 1,2,3. Signalering kan blockeras med hjälp av mutanter som förlorar sin funktion, uttryck av ektopiska hämmare eller antagonistläkemedel. Metoder för att aktivera signalering inkluderar agonistläkemedel, rekombinanta ligander, ektopiskt uttryck av ligander eller konstitutivt aktiva receptorer och mutanter som hämmar förlust av funktion. Dessa metoder sträcker sig längs ett kontinuum av experimentell kontroll. Till exempel kan mutanter och ektopiska uttryck hamna på släggsidan av kontinuum: Med dessa tillvägagångssätt kan dramatiska, systemiska förändringar i signalvägsaktivitet orsaka tidig död och förhindra undersökningar i senare skeden, eller med tiden kan det resultera i pleiotropa effekter som är svåra att särskilja. Dessutom är det ofta utmanande att självständigt manipulera en signalfunktion i taget, till exempel nivå eller varaktighet. Mot den andra änden av kontinuum erbjuder vissa metoder mer exakt experimentell kontroll, såsom mikrofluidiska enheter som exponerar prover för läkemedel eller rekombinanta proteiner med tidsmässig och ibland rumslig kontroll 18,24,25, eller genetiska metoder, inklusive värmechockinducerbara och vävnadsspecifika promotorer som kan erbjuda liknande fördelar16,26,27. Dessa metoder kan dock vara svåra att utföra, kanske inte är reversibla, kan ha relativt långsam kinetik eller dålig upplösning och kan vara otillgängliga i vissa modellsystem.
Molekylära optogenetiska metoder är ett kraftfullt tillägg till denna verktygslåda. Dessa metoder använder proteiner som reagerar på olika ljusvåglängder för att manipulera biologiska processer, inklusive signalering 8,12,13,14,15, och har utvecklats under årtionden för användning i en mängd olika system från cellodling till hela djur 12,13,28. Jämfört med historiska metoder kan molekylär optogenetik ofta erbjuda en högre grad av spatiotemporal kontroll över biologiska processer: Styrenheten i optogenetiska system är ljus, och kontroll av ljusvåglängd, intensitet, varaktighet och exponeringsfrekvens är relativt enkel. Med sofistikerade system som konfokalmikroskop och tvåfotonmikroskop är rumslig kontroll i det subcellulära området möjlig 29,30,31. Verktyg för att optogenetiskt manipulera signalering har utvecklats och tillämpats i flera system, inklusive de som beskrivs i Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 och Huang et al.34. Till exempel, genom att utnyttja den rumsliga kontroll som optogenetiken ger, användes denna strategi nyligen för att modifiera en signalgradient i Drosophila-embryon, vilket visar att flugembryogenesen är förvånansvärt robust mot förändringar i denna gradient22. Reversibiliteten och den snabba on/off-kinetiken hos optogenetiska signalaktivatorer har också gjort dem till attraktiva verktyg för att undersöka avkodningen av signaleringsdynamik 8,12,13,14,15,34,35,36.
Det tidiga zebrafiskembryot är ett in vivo-system som är väl lämpat för optogenetiska studier eftersom det är externt befruktat, transparent, mikroskopvänligt och genetiskt hanterbart. Ljusexponering är lättare att leverera till embryon som utvecklas utanför modern, ljus kan tränga igenom och komma åt deras icke-ogenomskinliga vävnader, levande zebrafiskembryon tolererar avbildning väl (förutom att de är transparenta), och befintliga genetiska metoder ger enkla möjligheter till knockdown- och överuttrycksexperiment, förutom utvecklingen av användbara transgena37.
Nyligen utvecklades optogenetiska verktyg för att aktivera BMP38– och Nodal39-signalering i zebrafiskembryon med exponering för blått ljus (Figur 1). Vi hänvisar till dessa verktyg som bOpto-BMP och bOpto-Nodal (b för blåljusaktiverad och Opto för optogenetisk). bOpto-BMP/Nodal är baserade på liknande mekanismer för aktivering av vägar. Bindningen av BMP- eller nodalligander till deras respektive receptorserin-treoninkinaser driver receptorkinasdomäninteraktioner som leder till fosforylering av signaleffektorer (Smad1/5/9 för BMP och Smad2/3 för Nodal). Fosforylerade signaleffektorer translokerar sedan till kärnan och reglerar målgenuttryck3 (Figur 1A,D). Dessa receptorkinasinteraktioner kan göras ljusresponsiva genom att koppla receptorkinaser till ljuskänsliga dimeriserande proteiner: Med ljusexponering bör dessa chimära proteiner dimeriseras, vilket får receptorkinasdomänerna att interagera och aktivera signalering (Figur 1B,C,E,F). Det är viktigt att notera att bOpto-BMP/Nodal, i motsats till endogena receptorer, inte innehåller extracellulära ligandbindande domäner, vilket säkerställer ligandoberoende aktivitet (Figur 1C,F). Denna optogenetiska aktiveringsstrategi uppnåddes först med receptortyrosinkinaser40,41,42 och tillämpades sedan på receptorserin-treoninkinaser.
bOpto-BMP/Nodal använder den blåljuskänsliga (~450 nm) homodimeriserande ljus-syre-spänningsavkänningsdomänen (LOV) från algen Vaucheria fridiga AUREO1-proteinet (VfLOV)43,44. Dessa konstruktioner består av ett membran-riktat myristoylering-motiv följt av antingen BMP- eller nodalreceptorkinasdomäner, sammansmälta till en LOV-domän (Figur 1B,E). Exponering för blått ljus bör orsaka LOV-homodimerisering, vilket resulterar i interaktioner mellan receptorkinasdomäner som leder till respektive Smad-fosforylering och aktivering av signalvägar (figur 1C,F). För bOpto-BMP visade sig en kombination av konstrukt med typ I-receptorkinasdomänerna från Acvr1l (även känd som Alk8) och BMPR1aa (även känd som Alk3) och typ II-receptorkinasdomänen från BMPR2a optimalt aktivera signalering38 (Addgene #207614, #207615 och #207616). För bOpto-Nodal används en kombination av konstrukt med typ I-receptorkinasdomänen från Acvr1ba och typ II-receptorkinasdomänen från Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal har introducerats i tidiga zebrafiskembryon genom att injicera mRNA i encellsstadiet, och använts för att undersöka betydelsen av signaleringslängd i nodaltolkning39, för att avgöra varför zebrafiskar förlorar förmågan att svara på nodal45, och för att undersöka hur BMP-målgener svarar på olika BMP-signaleringsnivåer38. Det är troligt att dessa verktyg kommer att fortsätta att vara användbara i en rad olika framtida utredningar. Men styrkan hos optogenetiska signalaktivatorer är också deras svaghet: ljuskänsliga prover måste behandlas med försiktighet för att undvika oavsiktlig ektopisk signalaktivitet. Exponering för rumsljus eller solljus kan aktivera bOpto-BMP/Nodal.
Detta protokoll ger praktiska förslag för användning av mRNA-kodade LOV-baserade BMP- och Nodal-aktivatorer i tidiga zebrafiskembryon. Den börjar med att beskriva en strategi för att bygga en ljuslåda för att kontrollera enhetlig ljusexponering och temperatur (Figur 2, Tilläggsfil 1, Tilläggsfil 2, Tilläggsfil 3, Tilläggsfil 4, Tilläggsfil 5, Tilläggsfil 6, Tilläggsfil 7, Tilläggsfil 8). Den beskriver sedan två viktiga kontrollexperiment som avgör om en optogenetisk signalaktivator beter sig som förväntat – dvs. aktiverar signalvägsaktivitet endast när den utsätts för ljus (figur 3). Den första kontrollanalysen innebär att fenotyper undersöks en dag efter befruktning i ljusexponerade och oexponerade embryon (Figur 3A). mRNA-injicerade ljusexponerade embryon, men inte oexponerade embryon, bör fenokopiera BMP eller nodalt överuttryck (Figur 4A,B; I synnerhet BMP-fenotyper är tydligt urskiljbara vid denna tidpunkt46). Denna analys ger en snabb aktivitetsavläsning. I den andra kontrollanalysen, för att avgöra om fenotyper orsakas specifikt av överskott av BMP eller Nodal-signalering och för att direkt observera förändringen i signaleringsnivåer, används immunofluorescensfärgning för att detektera fosforylerade signaleffektorer (pSmad1/5/9 respektive pSmad2/3) efter en 20 minuters ljusexponering runt sent blastula/tidigt gastrulationsstadium, när signalaktiviteten har beskrivits väl12, 16,17,47,48,49,50 (figur 3B och figur 4C). (Observera att även om rumsligt lokaliserad aktivering har demonstrerats för både bOpto-BMP38 och bOpto-Nodal39, beskriver detta protokoll endast enhetlig ljusexponering och aktiveringsstrategier för signalering.) Det är tillrådligt att utföra dessa kontrollexperiment innan bOpto-BMP/Nodal appliceras på specifika forskningsfrågor för att bestämma idealiska lokala experimentella förhållanden.
Injektion av mRNA är den nuvarande strategin för att leverera bOpto-BMP/Nodal till zebrafiskembryon. Denna metod har flera nackdelar. För det första varierar den lämpliga mängden mRNA mellan olika laboratorier. Den mängd som används bör vara tillräcklig för att aktivera signalering på ett robust sätt med ljusexponering, men utan oavsiktlig mörkeraktivering. Det är en bra idé att testa flera mängder för att hitta optimala mRNA-nivåer, och när de väl är etablerade, skapa alikvoter av en mastermix för att reproducerbart introducera samma mängd mRNA. För det andra kan ojämn fördelning av injicerat mRNA leda till ojämn signalaktivering. Injicering i mitten av cellen (inte äggulan) tros främja jämn mRNA-distribution. Slutligen, eftersom injicerat mRNA bryts ned med tiden, kanske detta tillvägagångssätt inte är lämpligt för experiment på äldre embryon. I framtiden skulle dessa problem kunna åtgärdas genom transgena zebrafisklinjer som allmänt uttrycker bOpto-BMP/Nodal med en maternell eller läkemedelsinducerbar promotor. Även om det kan vara en utmaning att arbeta med potentiellt ljuskänsliga vuxna zebrafiskar i detta sammanhang, har zebrafiskar 61,62 och Drosophila 22,34,35,63 transgena med optogenetiska verktyg framgångsrikt utvecklats.
Att undvika oavsiktlig fotoaktivering är en allmän utmaning med optogenetiska verktyg. För enkelhetens skull, behandla injicerade embryon äldre än 1,5 hpf som ljuskänsliga. Oavsiktlig ljusexponering kan ofta undvikas genom att helt enkelt slå in tallrikar eller fat med aluminiumfolie. För experiment som kräver visuell observation av levande embryon äldre än 1,5 hpf är det dock möjligt att använda röda ljuskällor eller att täcka vita ljuskällor med billigt gelfilterpapper som blockerar LOV-dimeriserande våglängder (Materialförteckning).
Ljuslådan som beskrivs här är utformad för specifika applikationer som kräver exakt kontroll över ljusinstrålningsnivåer, dynamik och våglängder (figur 2). Andra fördelar med denna ljuslåda inkluderar enhetlig ljusexponering, försumbar oavsiktlig provuppvärmning, gott om utrymme för flera 6-brunnsplattor och långlivade, spektralt välkarakteriserade ljuskällor. Olika ljusexponeringsstrategier kan dock vara att föredra beroende på forskningsansökan. Många laboratorier har utvecklat enklare och mer kostnadseffektiva enhetliga ljusexponeringssystem med mindre fotavtryck, inklusive att fodra inkubatorer med LED-remsor, hänga upp LED-paneler över prover eller införliva lysdioder i odlingsskållock 32,38,39,40,64,65,66 . Det är viktigt att notera att ljuslådan som används i detta protokoll inte tillåter användare att självständigt reglera enskilda brunnar (i motsats till Bugaj et al.52) eller ge rumslig kontroll över ljusexponeringen. Spatialt lokaliserad optogenetisk aktivering har demonstrerats med bOpto-BMP38 och bOpto-Nodal39 med hjälp av lasrar i SPIM respektive konfokala system, och har också realiserats med många andra optogenetiska strategier i en mängd olika modellsystem (diskuteras i Rogers och Müller12). Vissa tillvägagångssätt har till och med uppnått subcellulär rumslig upplösning 29,30,31. Även om implementeringen av rumsligt lokaliserade ljusexponeringssystem ligger utanför ramen för detta protokoll, är rumsliga aktiveringsexperiment med bOpto-BMP/Nodal teoretiskt möjliga med specialutrustning som digitala mikrospegelenheter eller maskeringsmetoder. Läsarna uppmuntras att utforska den omfattande litteraturen om gör-det-själv-ljuslådor för optogenetiska experiment innan de bestämmer sig för en ljusexponeringsstrategi (se t.ex. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar och Khammash 53 och mer på https://www.optobase.org/materials/).
Molekylära optogenetiska strategier erbjuder ofta en högre grad av spatiotemporal kontroll över biologiska processer jämfört med historiska metoder som mutanter, ektopiskt genuttryck, rekombinanta proteiner och läkemedel. Läsare som är intresserade av fördelarna med optogenetiska metoder kan utforska andra publicerade verktyg som finns tillgängliga i zebrafiskar och andra organismer. Dessa inkluderar verktyg för att manipulera ytterligare signalvägar 32,65,67,68, reglera genuttryck 61,64,66,69,70,71, ändra proteinlokalisering 31,72 och aktivera apoptos 62. Dessa verktyg och många andra är bekvämt katalogiserade på OptoBase, en kurerad webbresurs för molekylära optogenetikmetoder28. För dem som inspireras att skapa nya optogenetiska verktyg innehåller resursen också användbara beskrivningar av ljuskänsliga proteiner som har använts i ett brett spektrum av strategier, inklusive ljuskänsliga proteiner som svarar på gröna, röda och nära infraröda våglängder. Vi är glada över att det vetenskapliga samfundet kommer att inse den fulla potentialen hos molekylära optogenetiska metoder.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen av detta protokoll tillhandahölls av NICHD Intramural Program till KWR (ZIA HD009002-01). Vi tackar Jeff Farrell och hans labb för deras upplysande feedback, Will Anderson för utmärkt teknisk support, Leanne Iannucci för stresstestning av protokollet och mätning av instrålning, och NIH Shared Zebrafish-anläggningen för deras hårda arbete med att hålla zebrafisken frisk.
Building a light box & Light exposure protocol | |||
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
Generating mRNA | |||
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
Injecting mRNA | |||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |