Denne protokollen demonstrerer enkeltfiberisolasjon fra frysetørket human skjelettmuskulatur og fibertypeklassifisering i henhold til Myosin heavy chain (MHC) isoform ved bruk av prikkblottingsteknikken. Identifiserte MHC I og II fiberprøver kan deretter analyseres videre for fibertypespesifikke forskjeller i proteinuttrykk ved bruk av vestlig blotting.
Teknikken beskrevet her kan brukes til å identifisere spesifikke myosin heavy chain (MHC) isoformer i segmenter av individuelle muskelfibre ved hjelp av dot blotting, heretter referert til som Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Denne protokollen beskriver prosessen med frysetørking av menneskelig skjelettmuskulatur og isolering av segmenter av enkeltmuskelfibre. Ved bruk av MyDoBID klassifiseres type I- og II-fibre med henholdsvis MHCI- og IIa-spesifikke antistoffer. Klassifiserte fibre blir deretter kombinert i fibertypespesifikke prøver for hver biopsi.
Det totale proteinet i hver prøve bestemmes av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og UV-aktivert gelteknologi. Fibertypen av prøver valideres ved hjelp av vestlig blotting. Viktigheten av å utføre normalisering av proteinbelastning for å forbedre målproteindeteksjon over flere vestlige flekker er også beskrevet. Fordelene ved å konsolidere klassifiserte fibre i fibertypespesifikke prøver sammenlignet med enkeltfiber vestlige blots, inkluderer prøveallsidighet, økt prøvegjennomstrømning, kortere tidsinvestering og kostnadsbesparende tiltak, samtidig som verdifull fibertypespesifikk informasjon som ofte overses ved hjelp av homogeniserte muskelprøver. Formålet med protokollen er å oppnå nøyaktig og effektiv identifisering av type I- og type II-fibre isolert fra frysetørkede humane skjelettmuskelprøver.
Disse individuelle fibrene blir deretter kombinert for å lage type I og type II fibertypespesifikke prøver. Videre er protokollen utvidet til å omfatte identifisering av type IIx-fibre, ved bruk av aktin som markør for fibre som var negative for MHCI og MHCIIa, som er bekreftet som IIx-fibre ved vestlig blotting. Hver fibertypespesifikk prøve brukes deretter til å kvantifisere uttrykket av forskjellige målproteiner ved hjelp av vestlige blottingsteknikker.
Skjelettmuskulatur er et heterogent vev, med distinkte cellulære metabolske og kontraktile egenskaper som er avhengig av om cellen (fiber) er langsom rykk (type I) eller rask rykning (type II). Fibertypen kan identifiseres ved å undersøke isoformene myosin heavy chain (MHC), som avviger fra hverandre på flere måter, inkludert sammentrekningstid, forkortelseshastighet og utmattelsesmotstand1. Store MHC-isoformer inkluderer type I, type IIa, type IIb og type IIx, og deres metabolske profiler er enten oksidative (type I og IIa) eller glykolytiske (IIx, IIb)1. Andelen av disse fibertypene varierer i muskeltype og mellom arter. Type IIb er mye funnet i gnagermuskel. Menneskelige muskler inneholder ingen type IIb-fibre og består hovedsakelig av MHC-isoformer type I- og IIa-fibre, med en liten andel IIx-fibre2. Proteinuttrykksprofiler varierer mellom forskjellige fibertyper og kan endres med aldring3, øvelse 4,5 og sykdom6.
Måling av cellulære responser i forskjellige skjelettmuskelfibertyper blir ofte oversett eller ikke mulig på grunn av undersøkelse av muskelhomogenater (en blanding av alle fibertyper). Single-fiber western blot tillater undersøkelse av flere proteiner i individuelle muskelfibre7. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å produsere nye og informative enkeltfiberegenskaper som ikke var mulig å oppnå ved bruk av homogenatpreparater. Imidlertid er det noen begrensninger i den opprinnelige single-fiber western blot-metoden, inkludert den tidkrevende naturen, manglende evne til å generere prøvereplikater og bruk av dyre, følsomme forbedrede kjemiluminescensreagenser (ECL). Hvis ferskt vev brukes, er denne metoden ytterligere begrenset på grunn av tidsbegrensningene for å måtte isolere individuelle fibre innen en begrenset tidsramme (dvs. 1-2 timer). Heldigvis reduseres denne begrensningen ved å isolere enkeltfibersegmenter fra frysetørket vev8. Imidlertid er fiberinnsamling fra frysetørkede prøver begrenset av størrelsen og kvaliteten på det biopsierte vevet.
Fibertypeidentifikasjon ved hjelp av punktblottingsmetoden9 har blitt betydelig utdypet og utvidet i denne omfattende protokollen. Tidligere har det blitt vist at så lite som ~ 2-10 mg våtvekt muskelvev er tilstrekkelig for frysetørking og enkeltfiber MHC isoform proteinanalyse9. Christensen et al.9 brukte 30% av et ~ 1 mm fibersegment for å oppdage MHC-isoformen tilstede ved prikkblotting, som ble bekreftet av vestlig blotting. Dette arbeidet viste at ved å erstatte vestlig blotting med prikkblotting, ble de totale kostnadene redusert med ~ 40 ganger (for 50 fibersegmenter). Fibre ble deretter “samlet” i type I og type II prøver, som tillot eksperimentell replikasjon9. Likevel var en begrensning at bare to fibertypespesifikke prøver ble oppnådd: type I (MHCI positiv) og type II (MHCII positive fibre), med type II-prøver som inneholdt en blanding av MHCIIa og MHCIIx 6,10. Spesielt demonstrerer den nåværende protokollen hvordan rene type IIx-fibre kan identifiseres og gir en svært detaljert arbeidsflyt (oppsummert i figur 1), inkludert feilsøkingsstrategier for vanlige protokollproblemer.
Fiber samling
Basert på flere års erfaring kan de fleste forskere mestre denne teknikken; Praksis fører imidlertid til raskere og mer effektiv fiberinnsamling for nedstrømsanalyser. For å kunne isolere 30 enkeltfibersegmenter av en kvalitet for sammenslåing, anbefales det at det samles inn 50 fibersegmenter per prøve. Det anbefales å studere fiberinnsamlingsvideoen nøye og etter å ha utført to treningsøkter (~ 50 fibre per økt) for å oppnå en rimelig standard. Alle innsamlede fibre gjen…
The authors have nothing to disclose.
Antistoffene mot MHC I (A4.840) og MHCIIa (A4.74) som ble brukt i denne studien ble utviklet av Dr. H. M. Blau og antistoffet mot MHCIIx (6H1) ble utviklet av Dr. CA Lucas og hentet fra utviklingsstudiene Hybridoma Bank (DSHB), takket være regi av National Institute of Child Health and Human Development og vedlikeholdt av University of Iowa, Institutt for biovitenskap (Iowa City, IA). Vi takker Victoria L. Wyckelsma for å gi de menneskelige muskelprøvene til denne studien. De fleste bildene i figur 1 er hentet fra BioRender.com.
Finansiering:
Denne studien fikk ingen ekstern finansiering.
1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
Grey lead pencil | N/A | N/A | |
Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
Lamp | N/A | N/A | |
Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
Petri dish lid | N/A | N/A | |
Plastic tweezers | N/A | N/A | |
Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
Rocker | N/A | N/A | |
Ruler | N/A | N/A | |
Scissors | N/A | N/A | |
Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
Vortex | N/A | N/A | |
Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |