Summary

Identificación del tipo de fibra del músculo esquelético humano

Published: September 22, 2023
doi:

Summary

Este protocolo demuestra el aislamiento de una sola fibra del músculo esquelético humano liofilizado y la clasificación del tipo de fibra de acuerdo con la isoforma de la cadena pesada de miosina (MHC) utilizando la técnica de transferencia de puntos. Las muestras de fibra MHC I y II identificadas se pueden analizar más a fondo para detectar diferencias específicas del tipo de fibra en la expresión de proteínas mediante Western blot.

Abstract

La técnica descrita aquí se puede utilizar para identificar isoformas específicas de la cadena pesada de miosina (MHC) en segmentos de fibras musculares individuales mediante transferencia de puntos, en lo sucesivo denominada detección de la cadena pesada de la osina mediante laasignación de Dot Bpara la entificación de IDdel tipo de fibra muscular (MyDoBID). Este protocolo describe el proceso de liofilización del músculo esquelético humano y el aislamiento de segmentos de fibras musculares individuales. Con MyDoBID, las fibras de tipo I y II se clasifican con anticuerpos específicos de MHCI y IIa, respectivamente. Luego, las fibras clasificadas se combinan en muestras específicas para cada tipo de fibra para cada biopsia.

La proteína total en cada muestra se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) y tecnología de gel activado por UV. El tipo de fibra de las muestras se valida mediante Western blot. También se describe la importancia de realizar la normalización de la carga de proteínas para mejorar la detección de proteínas diana a través de múltiples Western blots. Los beneficios de consolidar las fibras clasificadas en muestras específicas del tipo de fibra en comparación con las Western blots de una sola fibra, incluyen la versatilidad de la muestra, el aumento del rendimiento de la muestra, la menor inversión de tiempo y las medidas de ahorro de costos, todo mientras se conserva la valiosa información específica del tipo de fibra que con frecuencia se pasa por alto utilizando muestras musculares homogeneizadas. El propósito del protocolo es lograr una identificación precisa y eficiente de las fibras de tipo I y tipo II aisladas de muestras de músculo esquelético humano liofilizado.

Estas fibras individuales se combinan posteriormente para crear muestras específicas de tipo de fibra de tipo I y tipo II. Además, el protocolo se amplía para incluir la identificación de fibras de tipo IIx, utilizando Actina como marcador de fibras que fueron negativas para MHCI y MHCIIa, que se confirman como fibras IIx por Western blot. A continuación, se utiliza cada muestra específica de tipo de fibra para cuantificar la expresión de varias proteínas diana mediante técnicas de Western blot.

Introduction

El músculo esquelético es un tejido heterogéneo, con distintas propiedades celulares metabólicas y contráctiles que dependen de si la célula (fibra) es de contracción lenta (tipo I) o de contracción rápida (tipo II). El tipo de fibra se puede identificar examinando las isoformas de la cadena pesada de miosina (MHC), que difieren entre sí de varias maneras, incluido el tiempo de contracción, la velocidad de acortamiento y la resistencia a la fatiga1. Las principales isoformas del MHC incluyen el tipo I, el tipo IIa, el tipo IIb y el tipo IIx, y sus perfiles metabólicos son oxidativos (tipo I y IIa) o glucolíticos (IIx, IIb)1. La proporción de estos tipos de fibra varía según el tipo de músculo y entre especies. El tipo IIb se encuentra ampliamente en el músculo de los roedores. Los músculos humanos no contienen fibras de tipo IIb y consisten predominantemente en isoformas MHC de fibras de tipo I y IIa, con una pequeña proporción de fibras IIx2. Los perfiles de expresión de proteínas varían entre los diferentes tipos de fibra y pueden alterarse con el envejecimiento3, el ejercicio 4,5 y la enfermedad 6.

La medición de las respuestas celulares en diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas a menudo se pasa por alto o no es posible debido al examen de los homogeneizados musculares (una mezcla de todos los tipos de fibras). El Western blot de una sola fibra permite la investigación de múltiples proteínas en fibras musculares individuales7. Esta metodología se ha utilizado previamente para producir características novedosas e informativas de una sola fibra que no eran posibles de obtener utilizando preparaciones homogeneizadas. Sin embargo, existen algunas limitaciones de la metodología original de Western blot de una sola fibra, incluida la naturaleza que consume mucho tiempo, la incapacidad de generar réplicas de muestras y el uso de reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) costosos y sensibles. Si se utiliza tejido fresco, este método se limita aún más debido a las limitaciones de tiempo de la necesidad de aislar fibras individuales dentro de un período de tiempo limitado (es decir, 1-2 h). Afortunadamente, esta restricción se mitiga aislando segmentos de una sola fibra del tejido liofilizado8. Sin embargo, la recolección de fibras de muestras liofilizadas está limitada por el tamaño y la calidad del tejido biopsiado.

La identificación del tipo de fibra mediante el método de transferencia de puntos9 se ha desarrollado y ampliado significativamente en este protocolo integral. Anteriormente, se ha demostrado que tan solo ~ 2-10 mg de tejido muscular de peso húmedo es adecuado para la liofilización y el análisis de proteínas isoformadas de MHC de fibraúnica 9. Christensen et al.9 utilizaron el 30% de un segmento de fibra de ~1 mm para detectar la isoforma MHC presente por transferencia de puntos, lo que se confirmó mediante Western blot. Este trabajo mostró que al sustituir la Western blot por la transferencia de puntos, los costos generales se redujeron en ~ 40 veces (para 50 segmentos de fibra). A continuación, las fibras se “agruparon” en muestras de tipo I y II, lo que permitió la replicación experimental9. Sin embargo, una limitación fue que solo se obtuvieron dos muestras específicas para cada tipo de fibra: tipo I (fibras MHCI positivas) y tipo II (fibras MHCII positivas), con muestras de tipo II que contenían una mezcla de MHCIIa y MHCIIx 6,10. En particular, el protocolo actual demuestra cómo se pueden identificar las fibras puras de tipo IIx y proporciona un flujo de trabajo muy detallado (resumido en la Figura 1), incluidas las estrategias de solución de problemas para problemas comunes del protocolo.

Protocol

Se obtuvieron muestras de músculo humano del vasto lateral de n = 3 (2 machos, 1 hembra), con edades comprendidas entre 70 y 74 años, en condiciones estériles, utilizando anestesia local (xilocaína) y aguja de Bergstrom modificada para aspiración manual11,12. Las muestras fueron un subconjunto de un estudio previo aprobado por el Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la Universidad de Victoria (HRETH11/221) y realizado de acuerdo con la Dec…

Representative Results

Identificación de fibras musculares individuales MHCI, MHCIIa y MHCIIx mediante transferencia de puntosUna característica de MyDoBID es la categorización de la intensidad variable de la señal MHC y Actina en una fibra determinada (Figura 4A). El tipo de fibra se identificó por la presencia o ausencia de isoformas MHCI e IIa (Figura 4B). Seis fibras no mostraron detección de MHC o actina, lo que indica que no se colectó fibra. Los resu…

Discussion

Recolección de fibra
Sobre la base de varios años de experiencia, la mayoría de los investigadores pueden dominar esta técnica; Sin embargo, la práctica conduce a una recolección de fibra más rápida y eficiente para los análisis posteriores. Para poder aislar 30 segmentos de fibra individuales de una calidad para agrupar, se recomienda recolectar 50 segmentos de fibra por muestra. Se recomienda estudiar cuidadosamente el video de recolección de fibras y después de realizar dos sesiones de p…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los anticuerpos contra MHC I (A4.840) y MHCIIa (A4.74) utilizados en este estudio fueron desarrollados por el Dr. H. M. Blau y el anticuerpo contra MHCIIx (6H1) fue desarrollado por el Dr. C. A. Lucas y obtenido del Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB), gracias a los auspicios del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano y mantenido por la Universidad de Iowa. Departamento de Ciencias Biológicas (Iowa City, IA). Agradecemos a Victoria L. Wyckelsma por proporcionar las muestras de músculo humano para este estudio. La mayoría de las imágenes de la Figura 1 provienen de BioRender.com.

Financiación:
Este estudio no recibió financiación externa.

Materials

1x Denaturing buffer Make according to recipe Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies  1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer Make according to recipe Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol N/A 100% ethanol can be sourced from any company Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich   A2066 Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales Mettler Toledo Model number: MSZ042101
Antibody enhancer Thermo Fischer Scientific 32110 Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL) N/A N/A
Benchtop centrifuge Eppendorf 5452 Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. Diploma Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich  BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002 Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever  Bio-Rad Laboratories 4560000 Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager  Bio-Rad Laboratories Model number: Universal hood III Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter Bio-Rad Laboratories 1704070 Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad) Bio-Rad Laboratories 1656001
ECL (enhanced chemiluminescence) Bio-Rad Laboratories 1705062 Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) Bio-Rad Laboratories 1610772 Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick Whatmann 3030917 Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps Dumont F6521-1EA Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid   N/A N/A Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System Labconco 7750030 Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 o N/A N/A Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers 1653320 Bio-Rad Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil N/A N/A
 Image lab software  Bio-Rad Laboratories N/A Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator Bio-Rad Laboratories 1660521 Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp N/A N/A
Magnetic stirrer with flea N/A N/A
Membrane roller  Bio-Rad Laboratories 1651279 Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. 
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL) N/A N/A
Mouse IgG HRP secondary Thermo Fisher Scientific 31430 Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary Abcam ab97230 Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody DSHB A4.840  Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody DSHB A4.74  Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody DSHB 6H1 Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm  Bio-Rad Laboratories 1620115 For Western blotting.
Petri dish lid N/A N/A
Plastic tweezers N/A N/A
Power Pack  Bio-Rad Laboratories 164-5050 Product name: Basic power supply.
Protein ladder Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm Bio-Rad Laboratories 1620177
Rabbit HRP secondary Thermo Fisher Scientific 31460 Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker N/A N/A
Ruler N/A N/A
Scissors N/A N/A
Stereomicroscope Motic SMZ-168
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059 Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free) Kimberly-Clark professional 34120 Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018 dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray Bio-Rad Laboratories 1704089
 UV-activation precast gel Bio-Rad Laboratories 5678085 Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex N/A N/A
Wash buffer (1x TBST) 10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma  BIOA0027-4L 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers Sistema Store bought Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.

Referências

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  2. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
  3. Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
  4. Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
  5. Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
  6. Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
  7. Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
  8. Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
  9. Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
  10. Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
  11. Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
  12. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  13. Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
  14. Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
  15. Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
  16. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
  17. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).

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Citar este artigo
Latchman, H. K., Wette, S. G., Ellul, D. J., Murphy, R. M., Frankenberg, N. T. Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (199), e65750, doi:10.3791/65750 (2023).

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