Fibertypeidentifikation af menneskelig skeletmuskulatur

Summary

Denne protokol demonstrerer enkeltfiberisolering fra frysetørret human skeletmuskulatur og fibertypeklassificering i henhold til Myosin heavy chain (MHC) isoform ved hjælp af dot blotting-teknikken. Identificerede MHC I og II fiberprøver kan derefter analyseres yderligere for fibertypespecifikke forskelle i proteinekspression ved hjælp af western blotting.

Abstract

Teknikken beskrevet her kan bruges til at identificere specifikke myosin heavy chain (MHC) isoformer i segmenter af individuelle muskelfibre ved hjælp af dot blotting, i det følgende benævnt Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Denne protokol beskriver processen med frysetørring af menneskelig skeletmuskulatur og isolering af segmenter af enkeltmuskelfibre. Ved hjælp af MyDoBID klassificeres type I- og II-fibre med henholdsvis MHCI- og IIa-specifikke antistoffer. Klassificerede fibre kombineres derefter til fibertypespecifikke prøver for hver biopsi.

Det totale protein i hver prøve bestemmes ved natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og UV-aktiveret gelteknologi. Fibertypen af prøver valideres ved hjælp af western blotting. Vigtigheden af at udføre proteinbelastningsnormalisering for at forbedre målproteindetektion på tværs af flere vestlige blots er også beskrevet. Fordelene ved at konsolidere klassificerede fibre i fibertypespecifikke prøver sammenlignet med enkeltfiber vestlige blots inkluderer prøvealsidighed, øget prøvegennemstrømning, kortere tidsinvestering og omkostningsbesparende foranstaltninger, samtidig med at værdifulde fibertypespecifikke oplysninger bevares, der ofte overses ved hjælp af homogeniserede muskelprøver. Formålet med protokollen er at opnå nøjagtig og effektiv identifikation af type I- og type II-fibre isoleret fra frysetørrede humane skeletmuskelprøver.

Disse individuelle fibre kombineres efterfølgende for at skabe type I og type II fibertypespecifikke prøver. Desuden udvides protokollen til at omfatte identifikation af type IIx-fibre ved hjælp af Actin som markør for fibre, der var negative for MHCI og MHCIIa, som bekræftes som IIx-fibre ved western blotting. Hver fibertypespecifik prøve bruges derefter til at kvantificere ekspressionen af forskellige målproteiner ved hjælp af western blotting-teknikker.

Introduction

Skeletmuskulatur er et heterogent væv med forskellige cellulære metaboliske og kontraktile egenskaber, der afhænger af, om cellen (fiber) er langsom træk (type I) eller hurtig trækning (type II). Fibertypen kan identificeres ved at undersøge myosin heavy chain (MHC) isoformer, som adskiller sig fra hinanden på flere måder, herunder sammentrækningstid, forkortelseshastighed og træthedsmodstand¹. De vigtigste MHC-isoformer omfatter type I, type IIa, type IIb og type IIx, og deres metaboliske profiler er enten oxidative (type I og IIa) eller glycolytiske (IIx, IIb)¹. Andelen af disse fibertyper varierer i muskeltype og mellem arter. Type IIb findes bredt i gnavermuskel. Menneskelige muskler indeholder ingen type IIb-fibre og består overvejende af MHC-isoformer type I- og IIa-fibre med en lille andel IIx-fibre². Proteinekspressionsprofiler varierer mellem forskellige fibertyper og kan ændres med aldring³, øvelse ^4,5 og sygdom⁶.

Måling af cellulære reaktioner i forskellige skeletmuskelfibertyper overses ofte eller er ikke mulig på grund af undersøgelsen af muskelhomogenater (en blanding af alle fibertyper). Single-fiber western blot giver mulighed for undersøgelse af flere proteiner i individuelle muskelfibre⁷. Denne metode er tidligere blevet anvendt til at producere nye og informative enkeltfiberegenskaber, der ikke var mulige at opnå ved anvendelse af homogenatpræparater. Der er dog nogle begrænsninger ved den oprindelige enkeltfiber western blot-metode, herunder den tidskrævende natur, manglende evne til at generere prøvereplikater og brugen af dyre, følsomme forbedrede kemiluminescensreagenser (ECL). Hvis der anvendes frisk væv, er denne metode yderligere begrænset på grund af tidsbegrænsningerne ved at skulle isolere individuelle fibre inden for en begrænset tidsramme (dvs. 1-2 timer). Heldigvis afbødes denne fastholdelse ved at isolere enkeltfibersegmenter fra frysetørret væv⁸. Imidlertid er fiberopsamling fra frysetørrede prøver begrænset af størrelsen og kvaliteten af det biopsierede væv.

Fibertypeidentifikation ved hjælp af dot blotting-metoden⁹ er blevet væsentligt uddybet og udvidet i denne omfattende protokol. Tidligere er det blevet påvist, at så lidt som ~ 2-10 mg vådvægts muskelvæv er tilstrækkeligt til frysetørring og enkeltfiber MHC isoform proteinanalyse⁹. Christensen et ^al.9 brugte 30% af et ~ 1 mm fibersegment til at detektere MHC-isoformen til stede ved dot blotting, hvilket blev bekræftet ved western blotting. Dette arbejde viste, at ved at erstatte western blotting med dot blotting, blev de samlede omkostninger reduceret med ~ 40 gange (for 50 fibersegmenter). Fibre blev derefter “poolet” i type I og type II prøver, hvilket muliggjorde eksperimentel replikation⁹. Ikke desto mindre var en begrænsning, at der kun blev opnået to fibertypespecifikke prøver: type I (MHCI-positive) og type II (MHCII-positive fibre) med type II-prøver indeholdende en blanding af MHCIIa og MHCIIx ^6,10. Især demonstrerer den aktuelle protokol, hvordan rene type IIx-fibre kan identificeres og giver en meget detaljeret arbejdsgang (opsummeret i figur 1), herunder fejlfindingsstrategier for almindelige protokolproblemer.

Protocol

Humane muskelprøver blev opnået fra vastus lateralis fra n = 3 (2 hanner, 1 hun), i alderen 70-74 år under sterile forhold ved hjælp af lokalbedøvelse (Xylocaine) og en Bergstrom-nål modificeret til manuel sugning11,12. Prøverne var en delmængde af en tidligere undersøgelse, der var godkendt af Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) og udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen13. D…

Representative Results

Identifikation af individuelle MHCI-, MHCIIa- og MHCIIx-muskelfibre ved hjælp af dot blottingEt træk ved MyDoBID er kategoriseringen af den varierende MHC- og Actin-signalintensitetsstyrke i en given fiber (figur 4A). Fibertype blev identificeret ved tilstedeværelse eller fravær af MHCI- og IIa-isoformer (figur 4B). Seks fibre viste ingen MHC- eller actindetektion, hvilket indikerer, at der ikke blev indsamlet fiber. Resultaterne af denn…

Discussion

Fiber indsamling
Baseret på flere års erfaring kan de fleste forskere mestre denne teknik; Praksis fører dog til hurtigere og mere effektiv fiberindsamling til downstream-analyser. For at kunne isolere 30 enkeltfibersegmenter af en kvalitet til pooling anbefales det, at der indsamles 50 fibersegmenter pr. prøve. Det anbefales at studere fiberindsamlingsvideoen omhyggeligt og efter at have udført to øvelsessessioner (~ 50 fibre pr. Session) for at opnå en rimelig standard. Alle indsamlede fibre …

Materials

1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.