Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

Summary

Dit protocol demonstreert isolatie van één vezel uit gevriesdroogde menselijke skeletspier- en vezeltypeclassificatie volgens Myosin heavy chain (MHC) isovorm met behulp van de dot blotting-techniek. Geïdentificeerde MHC I- en II-vezelmonsters kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op vezeltype-specifieke verschillen in eiwitexpressie met behulp van western blotting.

Abstract

De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om specifieke myosine heavy chain (MHC) isovormen in segmenten van individuele spiervezels te identificeren met behulp van dot blotting, hierna aangeduid als Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Dit protocol beschrijft het proces van het vriesdrogen van menselijke skeletspieren en het isoleren van segmenten van afzonderlijke spiervezels. Met behulp van MyDoBID worden type I- en II-vezels geclassificeerd met respectievelijk MHCI- en IIa-specifieke antilichamen. Geclassificeerde vezels worden vervolgens gecombineerd tot vezeltypespecifieke monsters voor elke biopsie.

Het totale eiwit in elk monster wordt bepaald door natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en UV-geactiveerde geltechnologie. Het vezeltype van monsters wordt gevalideerd met behulp van western blotting. Het belang van het uitvoeren van normalisatie van de eiwitbelasting om de detectie van doeleiwitten in meerdere westernvlekken te verbeteren, wordt ook beschreven. De voordelen van het consolideren van geclassificeerde vezels in vezeltypespecifieke monsters in vergelijking met westernblots met één vezel, zijn onder meer de veelzijdigheid van monsters, een grotere doorvoer van monsters, een kortere tijdsinvestering en kostenbesparende maatregelen, en dat alles met behoud van waardevolle vezeltypespecifieke informatie die vaak over het hoofd wordt gezien met behulp van gehomogeniseerde spiermonsters. Het doel van het protocol is om nauwkeurige en efficiënte identificatie te bereiken van type I- en type II-vezels geïsoleerd uit gevriesdroogde menselijke skeletspiermonsters.

Deze individuele vezels worden vervolgens gecombineerd om type I en type II vezeltype-specifieke monsters te creëren. Bovendien wordt het protocol uitgebreid met de identificatie van type IIx-vezels, waarbij actine wordt gebruikt als marker voor vezels die negatief waren voor MHCI en MHCIIa, die worden bevestigd als IIx-vezels door western blotting. Elk vezeltype-specifiek monster wordt vervolgens gebruikt om de expressie van verschillende doeleiwitten te kwantificeren met behulp van western blotting-technieken.

Introduction

Skeletspieren zijn een heterogeen weefsel, met verschillende cellulaire metabole en contractiele eigenschappen die afhankelijk zijn van het feit of de cel (vezel) langzame spiertrekkingen (type I) of snelle spiertrekkingen (type II) is. Het vezeltype kan worden geïdentificeerd door de myosine zware keten (MHC) isovormen te onderzoeken, die op verschillende manieren van elkaar verschillen, waaronder contractietijd, snelheid van verkorting en vermoeidheidsweerstand¹. De belangrijkste MHC-isovormen zijn type I, type IIa, type IIb en type IIx en hun metabole profielen zijn oxidatief (type I en IIa) of glycolytisch (IIx, IIb)¹. Het aandeel van deze vezeltypes varieert in spiertype en tussen soorten. Type IIb wordt veel aangetroffen in de spier van knaagdieren. Menselijke spieren bevatten geen type IIb-vezels en bestaan voornamelijk uit MHC-isovormen type I- en IIa-vezels, met een klein aandeel IIx-vezels². Eiwitexpressieprofielen variëren tussen verschillende vezeltypes en kunnen worden gewijzigd bij veroudering³, lichaamsbeweging ^4,5 en ziekte⁶.

Het meten van cellulaire responsen in verschillende skeletspiervezeltypes wordt vaak over het hoofd gezien of is niet mogelijk vanwege het onderzoek van spierhomogenaten (een mix van alle vezeltypes). Single-fiber western blot maakt het mogelijk om meerdere eiwitten in individuele spiervezels te onderzoeken⁷. Deze methodologie is eerder gebruikt om nieuwe en informatieve eigenschappen van één vezel te produceren die niet mogelijk waren om te verkrijgen met homogenaatpreparaten. Er zijn echter enkele beperkingen van de oorspronkelijke single-fiber western blot-methodologie, waaronder de tijdrovende aard, het onvermogen om monsterreplicaten te genereren en het gebruik van dure, gevoelige verbeterde chemiluminescentie (ECL)-reagentia. Als vers weefsel wordt gebruikt, is deze methode verder beperkt vanwege de tijdsdruk van het moeten isoleren van individuele vezels binnen een beperkt tijdsbestek (d.w.z. 1-2 uur). Gelukkig wordt deze beperking verzacht door segmenten van één vezel te isoleren van gevriesdroogd weefsel⁸. Het verzamelen van vezels uit gevriesdroogde monsters wordt echter beperkt door de grootte en kwaliteit van het biopsieweefsel.

Identificatie van het vezeltype met behulp van de dot blotting-methode⁹ is in dit uitgebreide protocol aanzienlijk uitgewerkt en uitgebreid. Eerder is aangetoond dat slechts ~2-10 mg spierweefsel met nat gewicht voldoende is voor vriesdrogen en MHC-isovormeiwitanalyse met één vezel⁹. Christensen et ^al.9 gebruikten 30% van een ~1 mm vezelsegment om de MHC-isovorm te detecteren die aanwezig was door dot-blotting, wat werd bevestigd door western blotting. Dit werk toonde aan dat door western blotting te vervangen door dot blotting, de totale kosten met ~40-voudig werden verlaagd (voor 50 vezelsegmenten). Vezels werden vervolgens “gepoold” in type I- en type II-monsters, wat experimentele replicatie mogelijk maakte⁹. Een beperking was echter dat er slechts twee vezeltypespecifieke monsters werden verkregen: type I (MHCI-positief) en type II (MHCII-positieve vezels), waarbij type II-monsters een mengsel van MHCIIa en MHCIIx ^6,10 bevatten. Het huidige protocol laat met name zien hoe zuivere type IIx-vezels kunnen worden geïdentificeerd en biedt een zeer gedetailleerde workflow (samengevat in figuur 1), inclusief strategieën voor het oplossen van problemen met veelvoorkomende protocolproblemen.

Protocol

Menselijke spiermonsters werden verkregen uit de vastus lateralis van n = 3 (2 mannen, 1 vrouw), in de leeftijd van 70-74 jaar oud onder steriele omstandigheden met behulp van lokale anesthesie (xylocaïne) en een Bergstrom-naald aangepast voor handmatige afzuiging11,12. De monsters waren een subset van een eerdere studie die was goedgekeurd door de Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) en uitgevoerd in overeenstemming met de Verklarin…

Representative Results

Identificatie van individuele MHCI-, MHCIIa- en MHCIIx-spiervezels met behulp van dot blottingEen kenmerk van MyDoBID is de categorisering van de variërende MHC- en Actine-signaalintensiteitssterkte in een bepaalde vezel (Figuur 4A). Het vezeltype werd geïdentificeerd door de aan- of afwezigheid van MHCI- en IIa-isovormen (Figuur 4B). Zes vezels vertoonden geen MHC- of actinedetectie, wat aangeeft dat er geen vezels waren verzameld. De res…

Discussion

Vezel inzameling
Op basis van enkele jaren ervaring kunnen de meeste onderzoekers deze techniek onder de knie krijgen; De praktijk leidt echter tot een snellere en efficiëntere vezelinzameling voor stroomafwaartse analyses. Om 30 enkelvoudige vezelsegmenten van een kwaliteit voor pooling te kunnen isoleren, wordt aanbevolen om 50 vezelsegmenten per monster te verzamelen. Het wordt aanbevolen om de video over het verzamelen van vezels zorgvuldig te bestuderen en na het uitvoeren van twee oefensessies …

Materials

1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.