Xenopus Kurbağa Yavrularında Retina Yaralanma Modellerinin Oluşturulması
Summary
Xenopus laevis kurbağa yavrularında retina hasarını veya retina dejenerasyonunu indüklemek için çeşitli protokoller geliştirdik. Bu modeller retinal rejenerasyon mekanizmalarını inceleme imkanı sunar.
Abstract
Retinal nörodejeneratif hastalıklar körlüğün önde gelen nedenleridir. Araştırılan çok sayıda terapötik strateji arasında, son zamanlarda kendi kendini onarmayı teşvik etmek özellikle çekici olarak ortaya çıktı. Retina onarımı için hücresel bir ilgi kaynağı, kök hücre potansiyelini ve anamniyotlarda olağanüstü bir rejeneratif kapasiteyi barındıran Müller glial hücresidir. Ancak bu potansiyel memelilerde çok sınırlıdır. Rejeneratif yeteneklere sahip hayvan modellerinde retinal rejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesi, memeli Müller hücrelerinin retinayı yenilemek için gizli yeteneğinin nasıl ortaya çıkarılacağına dair fikir vermelidir. Bu, rejeneratif tıpta terapötik stratejilerin geliştirilmesi için önemli bir adımdır. Bu amaçla, Xenopus’ta birkaç retina yaralanması paradigması geliştirdik: mekanik bir retina yaralanması, nitroredüktaz aracılı fotoreseptör koşullu ablasyonuna izin veren bir transgenik hat, CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtına dayalı bir retinitis pigmentosa modeli ve göz içi CoCl2 enjeksiyonları tarafından yönlendirilen bir sitotoksik model. Avantajlarını ve dezavantajlarını vurgulayarak, burada çeşitli dejeneratif koşullar oluşturan ve Xenopus’ta retinal rejenerasyonun incelenmesine izin veren bu protokol serisini açıklıyoruz.
Introduction
Dünya çapında milyonlarca insan, retinitis pigmentosa, diyabetik retinopati veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi körlüğe yol açan çeşitli retinal dejeneratif hastalıklardan muzdariptir. Bugüne kadar, bu koşullar büyük ölçüde tedavi edilemez kalmaktadır. Değerlendirilmekte olan mevcut terapötik yaklaşımlar arasında gen terapisi, hücre veya doku nakilleri, nöroprotektif tedaviler, optogenetik ve protez cihazlar yer almaktadır. Ortaya çıkan bir başka strateji, kök hücre potansiyeline sahip endojen hücrelerin aktivasyonu yoluyla kendi kendini yenilemeye dayanmaktadır. Retinanın majör glial hücre tipi olan Müller glial hücreleri, bu bağlamda hücresel ilgi kaynakları arasındadır. Yaralanma üzerine, farklılaşabilir, çoğalabilir ve nöronlar üretebilirler 1,2,3. Bu işlem zebra balığı veya Xenopus’ta çok etkili olmasına rağmen, memelilerde büyük ölçüde verimsizdir.
Bununla birlikte, mitojenik proteinlerle veya çeşitli faktörlerin aşırı ekspresyonu ile uygun tedavilerin, memeli Müller glia hücre döngüsünün yeniden girişini indükleyebileceği ve bazı durumlarda müteakip nörojenez taahhüdünü tetikleyebileceği gösterilmiştir 1,2,3,4,5. Ancak bu, tedaviler için büyük ölçüde yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle, Müller kök benzeri hücre özelliklerini verimli bir şekilde yeni hücresel terapötik stratejilere dönüştürebilen molekülleri tanımlamak için rejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgimizi artırmak gereklidir.
Bu amaçla, Xenopus’ta retinal hücre dejenerasyonunu tetikleyen çeşitli yaralanma paradigmaları geliştirdik. Burada, (1) hücre tipine özgü olmayan mekanik bir retina hasarı, (2) çubuk hücrelerini hedef alan NTR-MTZ sistemini kullanan koşullu ve geri dönüşümlü bir hücre ablasyon modeli, (3) bir CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtı, ilerleyici çubuk hücre dejenerasyonunu tetikleyen bir retinitis pigmentosa modeli ve (4) bir CoCl2-doza göre spesifik olarak konileri hedefleyebilen veya daha geniş retinal hücre dejenerasyonuna yol açabilen indüklenmiş sitotoksik model. Her paradigmanın özelliklerini, avantajlarını ve dezavantajlarını vurguluyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus kurbağa yavrularında çeşitli retina yaralanması paradigmalarının avantajları ve dezavantajları
Mekanik retina yaralanması
Xenopus kurbağa yavrularında nöral retinanın çeşitli cerrahi yaralanmaları gelişmiştir. Nöral retina ya tamamençıkarılabilir 15,16 ya da sadece kısmen çıkarılabilir16,17.</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) ortaklığında Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) ve UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) tarafından milletvekillerine verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
Referências
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Biologia do Desenvolvimento. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
