通过将微流体与质量光度法相结合来分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成

Summary

该协议将质量光度法与新型微流体系统相结合，以研究低亲和力蛋白质 – 蛋白质相互作用。该方法基于溶液中高浓度复合物的快速稀释，从而实现低亲和力测量并扩大了质量光度法的适用性。

Abstract

质量光度法是一种多功能的质量测量技术，可用于研究生物分子相互作用和溶液中的复合物形成，无需标记。质谱光度法通常适用于分析浓度范围为 100 pM-100 nM 的样品。然而，在许多生物系统中，有必要测量更浓缩的样品来研究低亲和力或瞬时相互作用。在这里，我们展示了一种方法，该方法有效地将可以通过质量光度法分析的样品浓度范围从纳摩尔扩大到数十微摩尔。

在该协议中，质量光度法与新型微流体系统相结合，以研究在微摩尔浓度范围内溶液中蛋白质复合物的形成。使用微流体系统，用户可以将样品保持在所需的更高浓度，然后稀释到纳摩尔范围 – 在质量光度测量前几毫秒。由于稀释的速度很快，数据是在样品的平衡发生变化（即复合物解离）之前获得的。

该技术用于测量免疫球蛋白 G （IgG） 抗体与新生儿 Fc 受体之间的相互作用，显示高阶复合物的形成，这些复合物无法通过静态质量光度测量来量化。

总之，质量光度法和微流体技术的结合使得表征微摩尔浓度范围内的样品成为可能，并且擅长测量亲和力较弱的生物分子相互作用。这些能力可以应用于一系列环境 – 包括生物治疗药物的开发和设计 – 能够对各种蛋白质-蛋白质相互作用进行彻底表征。

Introduction

蛋白质-蛋白质相互作用强调了大多数细胞功能，从免疫调节到 DNA 复制和翻译。因此，整个生命科学都迫切需要研究通常形成的各种异质复合物之间的广泛相互作用。然而，它们的检测、表征和定量通常具有挑战性，特别是对于低亲和力相互作用¹。

免疫沉淀测定通常用于检测高亲和力相互作用，但对于低亲和力和瞬时相互作用，检测在很大程度上是不可行的².也可以使用荧光技术，但需要添加可能具有破坏性的荧光标记²。冷冻电镜可以提供结构快照和以高空间分辨率形成的蛋白质复合物的集成读数，但通常还需要在太低的浓度下工作，无法对低亲和力相互作用进行成像。冷冻电镜还带来了与成本、可及性、样品制备和分析时间相关的挑战³.

此外，表面等离子体共振 （SPR） 已成为量化蛋白质-蛋白质相互作用的一种流行方法，尽管它需要蛋白质固定化，这会影响结合平衡并导致可变的导通率，从而降低测量精度 ^4,5。它还涉及数据收集和分析之前的几个分析步骤⁶.

质谱光度法是一种单分子技术，已用于分析蛋白质-蛋白质相互作用 ^5,6,7。它的工作原理是根据单分子或复合物落在玻璃盖玻片表面时散射的光来测量它们的质量⁸.质谱光度法测量已用于量化结合伴侣的相对丰度和它们形成的复合物的结合亲和力⁵。然而，与其他单分子技术一样，待测样品的浓度通常应小于 100 nM。如果浓度较高，落在玻璃表面的分子将在空间上重叠，导致数据质量差⁷.因此，在这些较低浓度下解离的较弱的相互作用（K_D ~微摩尔）无法可靠地测量，因为无法观察到未结合和结合物质的必要混合物⁵。

在这里，我们描述了一种基于新型耦合微流体质量光度测量装置的方法，该方法克服了这一限制。具体来说，将微流体系统与质量光度计结合使用，以有效地扩大可以通过质量光度法量化的相互作用范围。微流体已被证明为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一系列可能性，包括快速稀释以检测弱相互作用 ^1,9。本文所述的系统通过在微流控芯片上将样品快速稀释至10,000倍，并立即将其流过芯片的观察区域，从而使质量光度测量能够在分子开始稀释过程¹⁰后的50 ms内开始。当样品和缓冲液在芯片上的反向特斯拉阀混合器中混合时，就会发生稀释，两种溶液的相对流速决定了发生的稀释量（参见方案步骤8）。流量可通过微流控软件进行控制。改变流速可以改变物种的相对种群，因为它会影响玻璃表面着陆事件的数量，这是质量光度计测量的次数。

该过程的速度足够快，可以在交互的完整性被破坏之前完成测量（有关详细信息，另请参阅讨论）。这可以通过简要介绍一下一阶反应理论来理解，其中 .正向（缔合）速率常数为 k_f，反向（解离）速率常数为 k_b，平衡解离常数 （K_D） 定义为

K_D= k_b/ k_f

对于蛋白质结合，k_f通常受到反应物扩散¹¹ 的限制，因此限制在 10 6-10^{7 M-1}·^s-1 的范围内。因为范围有限，所以低亲和力（K_D~微摩尔）反应将有k_b≈ 1 ^s-1。即k_b= k_f ·K_D= （10^{6 M-1}·^s-1） （10-6 M） = 1 ^s-1， 配合物的半衰期约为 0.7 s^11,12。

我们的示例系统是 IgG 单克隆抗体曲妥珠单抗与 IgG 新生儿 Fc 受体 （FcRn） 的可溶性结构域的结合，它们是已知的相互作用伙伴¹³。先前发表的单独使用传统质量光度法（即手动稀释样品）获得的数据表明，这些蛋白质形成多个物种。FcRn单体、FcRn二聚体和未结合的IgG清晰可见，而IgG-FcRn复合物（比例为1：1和1：2）也检测到（pH 5.0时），但^丰度非常低5。这一观察结果提出了一个问题，即如果在较高浓度下测量，是否可以更清楚地检测到IgG-FcRn复合物的形成。事实上，将质量光度法与本文所述的耦合快速稀释方法相结合，通过增加测量的颗粒，为复合物的形成提供了更有力的证据。

这里描述的质量光度法和微流体协议使得表征具有K_D 到微摩尔范围的复合物的形成成为可能。K_D 的经验测定将需要进一步提高流量传感器的精度、泵的稳定性、芯片间的变化以及观察窗内的测量位置，因为所有这些因素都会影响从样品稀释到被测量的时间。

如果它们具有不同的分子量（相隔至少 25 kDa），则相同的方法可以应用于研究任何可溶性蛋白质之间的结合，这些分子量属于适合使用质量光度计分析的范围（30 kDa 至 6 MDa）。所获得的见解可能有助于在一系列背景下进行研究 – 从获得对细胞功能的机制理解到新生物治疗药物的设计。

Protocol

1. 准备仪器并启动软件 在开始任何测量之前，打开质量光度计并保持打开至少 1 小时。注意： 这是因为仪器需要达到恒定温度。不让质量光度计开启 1 小时可能会导致质量位移，因此导致结果不准确。 通过打开电源并按下隔离按钮（在质量光度计下方）来打开防振台。振动限制了质量亮度测量仪器的性能，因此防振台对于确保仪器的最大灵敏度非常重要。打开微流控盒。 启动数据采集软件和微流控控制软件。打开空气压缩机。 2. 制备蛋白质样品、缓冲液和清洁溶液 将 200 mL PBS （pH 7.4） 缓冲液加入干净的 200 mL 瓶中，将 200 mL PBS （pH 5.0） 缓冲液加入第二个 200 mL 瓶中。注意：在接下来的步骤中，需要将 200 mL 瓶子连接到“L”流量单位传感器。使用 pH 7.4 PBS 缓冲液进行校准测量，使用 pH 5.0 PBS 缓冲液进行样品测量。 在 0.5 mL 离心管中，以 1：10 的比例混合 IgG （2 μM） 和 FcRn （20 μM），总体积为 60 μL。FcRn和IgG的储备溶液分别为91.9μM和13.5μM。通过在离心管中混合 9 μL 储备 IgG + 13 μL 储备 FcRn + 38 μL PBS（pH 5.0，室温 [RT]）来制备反应物，总体积为 60 μL。两种反应物的最终浓度分别为IgG的2μM和FcRn的20μM。 在此过程中，将所有蛋白质储备液保持在冰上。 在另一个 0.5 mL 离心管中，分配 20 μL 浓度为 20 μM 的 β-淀粉酶校准品。例如，要制备此处使用的β-淀粉酶校准品，请按照2.3.1.1-2.3.1.2中描述的程序进行操作。将20mg β-淀粉酶粉末重悬于3.57mL PBS（5%甘油）中，对应于5.6mg / mL，摩尔浓度为100μM（分子量为56kDa）。 要稀释至 20 μM，将 200 μL 的 100 μM 原液与 800 μL PBS（pH 7.4，RT）混合在 1 mL 离心管中。 将样品在室温下孵育至少 30 分钟。注意：打开质量光度计后，开始准备样品和校准剂稀释度。对于该实验，将样品孵育120分钟。 在三个 50 mL 离心管中，等分试样：50 mL PBS （pH 7.4） – 清洗溶液 1 （CS1）、50 mL 0.5 M NaOH – 清洗溶液 2 （CS2） 和 50 mL 100% IPA – 清洗溶液 3 （CS3）。 3. 实验设置 要加载样品和校准品，请将校准离心管放置在微流体盒的位置 4 处，将样品离心管放置在微流体盒的位置 5（图 1）。 要加载清洁溶液，请将 CS1、CS2 和 CS3 放置在微流体盒的位置 1、2 和 3（图 1）。注意：样品、校准品和清洁溶液连接到多路开关（m 开关）。m 开关连接到“S”流量单元传感器。 将连接到缓冲管路的盖子拧到 200 mL （pH 7.4） 缓冲液瓶上。注意： 缓冲管路连接到截止阀，截止阀连接到“L”流量单元传感器。截止阀可防止在缓冲液流动停止时可能发生的任何虹吸效应。虹吸可导致稀释的残余液体返回缓冲液储液槽，从而污染缓冲液。 将微流控芯片放在制备板上。将“S”流量单元传感器的另一端推入微流控芯片中第一个通道的“样品入口”（图1）。样品线已完成。 将“L”流量单元传感器的另一管端推入微流控芯片中第一个通道的“缓冲入口”（图1）。缓冲线已完成。 为了收集流出物，将一根管子推到微流控芯片中第一个通道的“出口”;放置另一端，使其排入废物容器瓶或烧杯中（图 1）。 4. 用缓冲液灌注样品和缓冲液管路 打开缓冲管路上的手动截止阀。 在微流控控制软件中，将缓冲管路流速设置为 1000 μL/min，并确保缓冲管路压力不超过 110 mbar（图 2）。流动将自动在缓冲管路中开始（图 1）。注意： 如果缓冲管路压力超过 110 mbar，可能是由于空气通过流量传感器。如果压力在几秒钟内没有恢复正常，则可能是堵塞（通常是由于连接处的管道被挤压）。在这种情况下，停止流动并检查缓冲管路中的连接，从截止阀开始。 在微流控控制软件中，选择 m 开关的位置 1（对应于 PBS 缓冲液），然后将样品管路流速设置为 8 μL/min，并确保样品管路压力不超过 350 mbar。流动将自动在采样管路中开始（图 1）。 使用移液器吸头（或其他软塑料组件）从上方轻轻按压，靠近被困在芯片中的气泡，以去除气泡并确保它们通过出口排出。注意： 确保清除正在使用的通道的“混合器”和“观察区域”（图 1）部分中的所有气泡。注意不要用力过猛，因为这可能会损坏芯片。 5. 将微流控芯片放在质量光度计上并找到焦点 在质量光度计的物镜上滴一滴显微镜浸油。 将微流体芯片放在质量光度计的支架上，使“样品入口”朝上，并将其连接到载物台夹上（图1）。确保所有管道连接保持连接。 使用数据采集软件移动载物台，确保通道 1 的“观察区域”与物镜对齐（图 1）。 关闭质量光度计盖，然后按下数据采集软件中的 “液滴稀释查找焦点 ”选项。 检查数据采集软件左下角的白色对焦环（图3）。环中的间隙表明浸油中存在气泡;通过将载物台速度提高到最大并轻轻地横向移动载物台来消除这一点。 对焦完成后，等待 2-3 分钟，然后再进行第一次录音。然后，按 Record 记录 1 分钟的测量值，并确保（通过观察测量值）没有出现杂质。注意：杂质可能位于玻璃表面或缓冲液中。数据采集软件中的锐度值应在4.5%以上。 6. 质量光度法校准 在微流控控制软件中，将 m 开关切换到位置 4（对应于校准品），并确保样品管路流速设置为 8 μL/min，样品管路压力不超过 350 mbar（图 2）。校准剂将开始流经芯片。等待大约 1.5-2.5 分钟（或直到在数据采集软件上一致地看到校准品）。时间可能因样品管路长度而异。 一旦一致地看到校准品（即，事件数量足以进行准确的质量光度测量），在微流体控制软件中，将流速降低至 0.5 μL/min（该实验的目标稀释水平）。注意：从更高的流速开始，可以减少校准剂到达芯片所需的时间。 确保没有“太少”或“太多”的分子落在测量表面上（图4）。如果着陆事件密度不是“理想”（图4），请在微流体控制软件中更改流速。如果事件密度太低，则增加样品流速，直到观察到分离良好的着陆事件（但不要超过 8 μL/min）。如果过高，请降低样品流速（但不要低于 0.1 μL/min）。 如果样品管中的校准剂体积不足，请将 m 开关位置更改为 PBS pH 7.4 线（位置 1）以避免注入空气。 按 Record 并进行 60 秒测量。将文件保存在选定的文件夹中。注意：数据采集软件生成扩展名为 .mp 的文件。 7. 清洁样品管路并停止流动 在微流体控制软件中，切换到 m 开关的位置 2，并将样品压力更改为 800 mbar（图 2）。用 CS2 （NaOH） 冲洗系统 4 分钟。 切换到 m 开关的位置 3，然后用 CS3 （IPA） 冲洗系统 4 分钟。 切换到 m 开关的位置 1，用 CS1 （PBS） 冲洗系统 4 分钟。 在微流体控制软件中，通过将样品管路和缓冲管路压力设置为 0 并关闭缓冲阀来停止所有流量。 断开芯片与载物台的连接，然后将其放回制备板上。断开所有管子，并将样品管子末端放入废液瓶中。用异丙醇和湿巾清洁物镜。 8. 测量质量光度法样品 拧下连接到 200 mL （pH 7.4） 缓冲液瓶的盖子，然后将其拧到 200 mL （pH 5.0） 缓冲液瓶上。 重复步骤 3.4-5.6，但使用芯片的第二个通道而不是第一个通道。 在微流控控制软件中，将m开关切换到位置5（对应样品），将样品管路流速设置为8μL/min，并确保样品管路压力不超过350 mbar（图2）。 重复步骤 6.2-6.4 测量样品。要计算要使用的流速，请确保流速的倍数差与所需的样品稀释因子相匹配。例如，为了在这里实现 2000 倍的稀释，流速相差 2000 倍;缓冲液流速为1000 μL/min，样品流速为0.5 μL/min。在实验结束时，请始终按照清洁协议保持管路清洁。 9. 数据分析 数据采集完成后，启动数据分析软件（图 5）。 单击左上角的加号 （+） 图标，然后选择 .mp 校准文件。软件将开始分析加载的文件。根据测量的大小和数量，这可能需要几分钟使用数据采集软件采集数据时，请勿在数据分析软件中分析 .mp 文件，因为这样做可能会降低采集数据的质量。 按下 创建质量校准 按钮（右下角）。将打开一个对话框，其中显示了一个表格，其中填充了拟合峰的对比度值。 将值更改为拟合峰的已知质量值（对于β淀粉酶，这些值为 56 kDa、112 kDa 和 224 kDa），然后按 保存。新创建的校准文件（.mc 扩展名）将出现在 质量校准 面板（数据分析软件的左下角）（图 6）。 单击左上角的加号 （+） 图标，然后选择 .mp 示例文件。 要创建质量直方图， 如图 5 所示，请转到 Analysis 选项卡，选择 Histogram 模式和 Mass 绘图选项。根据需要调整 Bin 宽度、质量限制和其他参数。 如果需要，在导出图表和/或将整个工作区另存为.dmp文件之前，请在 “图表 ”选项卡中进一步自定义绘图。

Representative Results

质谱光度法测量IgG单克隆抗体曲妥珠单抗与IgG新生儿Fc受体（FcRn）可溶性结构域之间的相互作用。将两种蛋白质的 1：10 混合物（IgG 为 2 μM，FcRn 为 20 μM）分别在 PBS 中手动稀释至 10 nM 和 20 nM。 稀释步骤是必要的，因为质量光度法是一种单分子质量测量技术，只能分析 100 pM-100 nM 范围内的样品。尝试测量浓度超出此范围的样品可能会危及结果的准确性（图4）。该实验不包括在本议定书中，如前所述 5,6. 在质量光度测量实验中产生的质量直方图中，每个着陆事件的散射信号（或“对比度”）的强度绘制在x轴上，并通过质量对比度校准步骤将其转换为分子量。同时，y 轴表示在给定质量（或对比度）下计数的分子数。因此，峰值表示在 x 轴上显示的分子量范围内存在一组分子。构成峰值的事件（计数）数量反映了该群体的规模。 使用手动稀释进行质量光度测量得到质量直方图，其中两个最大的峰（基于蛋白质的预期分子量）对应于未结合的 FcRn 单体 （~50 kDa） 和 IgG 抗体单体 （~150 kDa）（图 7）。与先前发表的质量光度数据5 类似，未结合的物质很突出，而对应于复合物的质量范围的峰则不那么明显。 使用快速稀释微流体系统重复实验，在质量光度测量之前立即将混合物稀释至所需浓度。这种方法能够检测到额外的低亲和力复合物，这些复合物可能在手动稀释步骤中已经解离。为了获得在手动稀释实验中使用的相同 2000 倍稀释因子，将 1：10 的样品混合物（IgG 浓度为 2 μM，FcRn 浓度为 20 μM）以 0.5 μL/min 的速率流入微流控芯片，以及 PBS 缓冲液 （pH 5.0） 以 1 mL/min 的流速。为确保蛋白质在测量时不降解，在样品孵育 120 分钟后，在微流体系统流动下测量 IgG （2 μM） 和 FcRn （20 μM）。个别对照测量显示没有蛋白质降解（补充图1） 对于经过快速稀释的样品，可以再次观察到与FcRn单体（53 kDa）、FcRn二聚体（97 kDa）和IgG单体（148 kDa）相对应的峰。此外，在196 kDa和251 kDa处清楚地观察到另外两个峰，对应于化学计量为1：1和1：2的IgG-FcRn复合物（图7）。这两种复合物的预期质量分别为 200 kDa 和 250 kDa。质量测量的变异性在本研究中使用的质量光度计的测量误差为 ±5 （1：1 复合物为 2%，1：2 复合物为 0.4%）。 这些复合物仅在快速稀释的样品中存在，这与它们倾向于在较低浓度下解离的观点一致，其速度相对于手动稀释过程来说很快，但相对于使用微流体系统实现的快速稀释过程而言较慢15。 图 1：将微流体与质量光度法相结合。 （A，B）本协议中使用的微流体盒，从（A）正面和（B）顶部看到。将清洁溶液放置在位置 1-3，将样品和校准品放置在位置 4-6。所有解决方案都连接到 m 开关，m 开关连接到“小型”流量单元传感器。（C） 整个系统概况。计算机（左上角）连接到微流控盒（显示在缓冲液和样品管旁边）和质量光度计（右下），微流控芯片位于该位置。小流速监测仪 （FRMS） 监测流经样品管路的流量，而大流速监测仪 （FRML） 监测缓冲液流量。样品管和缓冲管连接到微流体芯片上的通道，该通道放置在质量光度计内部。（D） 每个芯片有三个通道。FRMS连接到样品入口，FRML连接到缓冲液入口。混合器区域是进行快速样品稀释的地方，而观察区域是进行质量光度测量的地方。出口由一个额外的流量传感器监控，以确保芯片中没有泄漏。请点击这里查看此图的较大版本. 图 2：微流体控制软件。 使用此软件，设置和监控流量、微流体系统的压力线以及多功能开关（m 开关）的位置。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 3：识别油中是否存在气泡。 数据采集软件的示例显示了一个清晰、完整的对焦环（左）和一个“破损”环，表明浸油中存在气泡（右）。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 4：分子落地事件数量太少、理想或太多的样品浓度的代表性示例。 在微流控芯片中，落在观察区域表面的分子将在质量光度图像的比率视图中显示为黑点。理想情况下，所需的浓度应能够在数据采集期间发生理想的着陆事件密度（中间）。如果着陆事件密度太低（顶部，“太少”），则无法完成对质量光度测量数据的准确统计分析。如果它太高（底部，“太多”），着陆分子将在空间上重叠，这将导致数据质量差。这些图像是使用质量光度计通过数据采集软件捕获的。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 5：用于质量光度测量的数据分析软件的屏幕截图。 在这里，可以加载从数据采集软件导出的 .mp 文件来分析数据。可以从处理过的数据中生成数字。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 6：该实验的质量对比度校准的屏幕截图。 使用的校准品是β-淀粉酶，已知可形成三种物质：单体 （56 kDa）、二聚体 （112 kDa） 和四聚体 （224 kDa）。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 7：质量直方图显示，只有在样品快速稀释后才能形成复合物。 图中显示了在手动稀释（橙色）或通过微流体HC系统（蓝色）快速稀释后测量含有IgG和FcRn的样品的质量直方图和相应的最佳拟合高斯分布。质量标签表明，高斯曲线的平均值与快速稀释后测得的质量直方图拟合。手动稀释后，观察到与FcRn单体（52 kDa，手动稀释测量）和IgG单体（152 kDa）相对应的峰。快速稀释后，除FcRn和IgG单体外，还清楚地观察到与FcRn二聚体和IgG-FcRn复合物相对应的峰，化学计量为1：1和1：2。 请点击这里查看此图的较大版本. 补充数据 图 1：快速稀释后对照样品的质谱光度测量显示没有蛋白质降解。 （A） 仅FcRn样本的质量直方图和最佳拟合高斯分布。快速稀释前的初始样品浓度为 20 μM，流速设定为 0.5 μL/min。可以观察到与FcRn单体（53 kDa）和FcRn二聚体（97 kDa）相对应的质量峰。（B） 仅 IgG（赫赛汀）样品的质量直方图和最佳拟合高斯分布。快速稀释前的初始样品浓度为 2 μM，流速设定为 1 μL/min。可以观察到对应于IgG单体（155 kDa）的单个质量峰。 请点击这里下载此文件。

Discussion

这里概述的协议提供了一种检测和量化低亲和力蛋白质 – 蛋白质相互作用的方法。它使用与快速稀释微流体系统耦合的质量光度计。质谱光度法是一种无标记的生物分析工具，可以可靠地测量溶液中生物分子¹⁶ 的分子量，适用于 30 kDa 至 6 MDa 范围内的生物分子。由于质量光度法是一种逐个分析样品的单分子技术，因此通常仅限于 100 pM-100 nM 浓度范围内的样品。超过这个范围，落在玻璃表面的分子会在空间上重叠，导致数据质量差;低于此范围，获得的数据太少，无法进行稳健的分析⁷.一个重要的结果是，它可以将蛋白质相互作用的研究限制在那些在该范围内形成结合和未结合物种混合物的蛋白质相互作用。

在这里，我们详细介绍了使用快速稀释微流体系统的分步协议，以有效地扩大适用于质量光度法的样品浓度范围。通过在微流控芯片上稀释样品，然后在 50 ms 内将其流过检测器观察窗口，该系统可以在相互作用平衡改变之前捕获未稀释样品中存在的复合物。在单独测量过程中，样品被连续输送到检测器。在这些条件下，当测量样品时，95% 的复合物将保持完整，即使是低亲和力相互作用 – K_D 约为微摩尔量级，解离速率快至 1 ^s-1。

这可以计算如下：对于正向速率 k_f和反向速率 k_b 的反应，

在平衡时，所有三种物质（A、B 和复合物 AB）的浓度保持不变，因此和 。在保守的假设下，扰动（在这种情况下是稀释）可能导致络合物解离，但正向（缔合）反应不进行，术语k _f [A] [B]可以被视为可以忽略不计，并且可以进行以下简化：

积分给出了平衡扰动后复合物在时间上的浓度的以下表达式：

因此，在平衡扰动后在时间 t 保持束缚的复合物部分为：

在 = 50 ms 时，对于 k_b≈ 1 ^s-1 的反应，馏分结合为 0.95，即 95%^11,12。

本文和之前的⁵ 次使用质谱光度法来研究 IgG 单克隆抗体曲妥珠单抗与 FcRn 可溶性结构域的结合。据报道，这两种结合伙伴在酸性 pH^{值为 17} 时以纳摩尔亲和力结合。质谱光度法用于定性评估结合伙伴在 pH 值为 5.0 时形成的复合物的丰度，并通过额外的微流体系统快速稀释样品。根据先前报告的结果⁵，该程序针对特定的蛋白质-蛋白质相互作用进行了优化。如果用户具有先验知识或优化了相关系统的实验条件，例如使用哪种缓冲液、初始蛋白质浓度、预期的化学计量以及使相互作用达到平衡所需的孵育量，则相同的程序可用于研究其他相互作用。

当手动稀释 IgG-FcRn 混合物时，即使已知这些蛋白质会相互作用，也很难检测到 IgG-FcRn 复合物的存在⁵。本文表明，快速稀释方法导致这些复合物的量显着增加。对于同一样品，当使用快速稀释时，均明显观察到 1：1 的 FcRn-IgG 复合物和 2：1 的 FcRn-IgG 复合物。这些复合物形成的差异证明了在广泛的浓度范围内研究生物分子相互作用系统的重要性。

此外，这些结果还表明，使用微流体和单分子分析来捕获弱相互作用是直接的，这填补了该方法的重大空白。由于质量光度法作为一种分析技术的优势，快速稀释微流体与质量光度法的结合具有吸引人的优势。也就是说，质量光度法不需要标记，涉及最少的样品制备，并且测量是在溶液中进行的。对于该协议，质量光度法的另一个关键优势是它能够区分和量化所有形成的物质（前提是它们具有>30 kDa的独特质量）。这与SPR形成鲜明对比，例如，SPR可以测量结合和解除结合的速率，但不能轻易提供化学计量信息⁸。

对于该协议，以及更一般的大规模光度测量实验，几个考虑因素是有帮助的。首先，最终蛋白质浓度应在质量光度法可以测量的极限（100 pM-100 nM）内。起始孵育浓度也应在微流体系统的范围内（最高 90 μM），并且理论上应高于相互作用¹⁰ 的实际 K_D。推荐的起点是在 μM 浓度下相互作用的物质之间的浓度混合比为 1：1。然后，该比例可以更改为 1：2、1：5，或者，如这种相互作用的情况，为 1：10。如果没有关于蛋白质相互作用的先前信息，用户将不得不优化实验，从每个伙伴的高浓度（推荐20μM）开始，以确定组分的亲和力是否在所提出的方法所维持的浓度范围内（即，形成复合物）。优化还可能涉及选择其他缓冲液条件以促进相互作用或滴定其中一种相互作用组分以确定正确的混合比。一旦确定了这些结果，就可以优化浓度和流速，以便为研究和方法提供最佳条件，例如，降低浓度以获得更好的峰分辨率。

其次，为了成功复制该实验，应尽量减少杂质。已知会对质量光度测量产生不利影响的常见杂质来源包括纯化后残留的其他蛋白质或细胞碎片、未经过滤的缓冲液、胶束形成去污剂（如果浓度过高）以及含有高浓度盐、甘油或其他成分的缓冲液。如上述议定书所述，应去除微流体系统中的气泡。如果样品具有高表面张力并且容易形成泡沫，则可能会在管道系统中形成气泡。浸油中也可能形成气泡，可以从对焦环检测到气泡（图3）。如果无法使用协议中描述的步骤去除气泡，另一种解决方案是使用干燥器和真空泵对样品进行脱气，将样品置于减压状态几分钟。不建议涡旋或摇晃高浓度的蛋白质溶液，因为这些动作可能会促进气泡的形成。

虽然这里展示了一种特定蛋白质-蛋白质相互作用的测量，但相同的协议可以应用于其他蛋白质-蛋白质相互作用系统，而无需进行重大修改。该协议的进一步未来方向将是使用测量值来计算所鉴定的复合物的K_D值，正如在质量光^度法5,7的其他地方所描述的那样。虽然先前的研究使用了涉及手动稀释和更强相互作用的实验数据，但分析原理可以很容易地应用于这种情况 – 前提是对微流体设备进行进一步改进（例如提高流量传感器精度和泵稳定性）。

除了蛋白质-蛋白质相互作用之外，联合质量光度法和快速稀释微流体方法可能还有更广泛的应用。质量光度法可用于评估样品纯度、聚集和均匀性^18,19;研究蛋白质寡聚化²⁰、大分子组装²¹或聚合化²²;以及其他领域。质谱光度分析也超越了蛋白质;它已被用于研究核酸与蛋白质²³、病毒颗粒²⁴ 和纳米颗粒²⁵ 之间的相互作用。因此，该协议描述了组合质量光度法微流体系统的重要应用 – 它能够在单个分子和复合物的水平上直接测量弱蛋白质 – 蛋白质相互作用。本申请的价值很高，因为它为直接表征通常难以研究的相互作用提供了可能性–与关键治疗领域的相关性有关。这种综合方法还可以作为对浓度高达数十微摩尔的样品进行更广泛调查的基础。

Materials

2-Propanol (Isopropanol)	VWR International LLC	20880.320
Data acquisition software	Refeyn	AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software	Refeyn	DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag	Sigma	SRP0624
Herceptin (IgG)	Cambridge Bioscience	HY-P9907-1mg
Mass photometer	Refeyn	TwoMP
Microfluidics box	Refeyn	MassFluidix HC system
Microfluidics chip	Refeyn	MassFluidix HC chip
Microfluidics control software	Fluigent	OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure	VWR International LLC	K812
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S2770
β-Amylase, from sweet potato	Sigma	A8781