केनोरहाब्डिस एलिगेंस रिसर्च के लिए बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने की पद्धति
Summary
प्रयोगशाला में केनोरहाब्डिस एलिगेंस के लिए खाद्य स्रोत जीवित एस्चेरिचिया कोलाई है। चूंकि बैक्टीरिया चयापचय रूप से सक्रिय होते हैं, इसलिए वे सी एलिगेंस में चयापचय और दवा अध्ययन में एक भ्रमित चर प्रस्तुत करते हैं।पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करके बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां वर्णित है।
Abstract
केनोरहाब्डिस एलिगेंस आनुवंशिकी, विकास, उम्र बढ़ने, चयापचय और व्यवहार में अनुसंधान के लिए एक सामान्य मॉडल जीव है। एलिगेंस जीवित बैक्टीरिया के आहार का उपभोग करते हैं, उनके खाद्य स्रोत की चयापचय गतिविधि कीड़े पर विभिन्न हस्तक्षेपों के प्रत्यक्ष प्रभावों की तलाश में प्रयोगों को भ्रमित कर सकती है। बैक्टीरियल चयापचय के भ्रामक प्रभावों से बचने के लिए, सी एलिगेंस शोधकर्ताओं ने पराबैंगनी (यूवी)-विकिरण, गर्मी-हत्या और एंटीबायोटिक दवाओं सहित बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया है। यूवी उपचार अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट है और तरल संस्कृति में इसका उपयोग नहीं किया जा सकता है क्योंकि प्रत्येक प्लेट को सफल जीवाणु हत्या के लिए जांच की जानी चाहिए। एक दूसरी उपचार विधि, हीट-किलिंग, बैक्टीरिया की बनावट और पोषण की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करती है, जिससे सी एलिगेंस की विकासात्मक गिरफ्तारी होती है। अंत में, एंटीबायोटिक उपचार बैक्टीरिया के विकास को रोकने के अलावा सी एलिगेंस फिजियोलॉजी को सीधे बदल सकता है। यह पांडुलिपि पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने के लिए एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करती है। पीएफए उपचार सेलुलर संरचना और पोषण सामग्री को संरक्षित करते हुए चयापचय गतिविधि को रोकने के लिए बैक्टीरिया कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन को क्रॉस-लिंक करता है। यह विधि उच्च-थ्रूपुट है और इसका उपयोग तरल संस्कृति या ठोस प्लेटों में किया जा सकता है, क्योंकि विकास के लिए पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया की एक प्लेट का परीक्षण पूरे बैच को मान्य करता है। पीएफए उपचार के माध्यम से चयापचय निष्क्रियता का उपयोग सी एलिगेंस में दवा या मेटाबोलाइट पूरक, तनाव प्रतिरोध, मेटाबोलॉमिक्स और व्यवहार के अध्ययन पर जीवाणु चयापचय के भ्रामक प्रभावों को खत्म करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
केनोरहाब्डिस एलिगेंस को मूल रूप से 1965 1 में एक मॉडल जीव के रूप में प्रस्तावित किया गया था और तब से आनुवंशिकी, विकास, व्यवहार, उम्रबढ़ने और चयापचय के अध्ययन में व्यापक रूप से अपनाया गया है। अपने बड़े ब्रूड आकार और पारदर्शी छल्ली के कारण, सी एलिगेंस फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स3 के साथ उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से अनुकूल है। उनका छोटा जीवन चक्र, हेर्मेथ्रोडिटिक प्रजनन और मनुष्यों के साथ आनुवंशिक होमोलॉजी भी सी एलिगेंस को विकास4 और उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान5 पर अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली बनाती है। इसके अलावा, सी एलिगेंस को बनाए रखना अपेक्षाकृत आसान है। कीड़े तरल संस्कृति में या ठोस आगर प्लेटों पर उगाए जा सकते हैं और जीवित एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50बैक्टीरिया 4 के आहार का उपभोग कर सकते हैं।
एलिगेंस का जीवित खाद्य स्रोत चयापचय, दवा पूरकता और व्यवहार के अध्ययन को भ्रमित कर सकता है। क्योंकि जीवित बैक्टीरिया का अपना चयापचय होता है, बैक्टीरिया को प्रभावित करने वाली प्रयोगात्मक स्थितियां कीड़े के लिए उपलब्ध पोषक तत्वों और चयापचयों को भी बदल देती हैं। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल आयरन, अमीनो एसिड और फोलेट सांद्रता में अंतर सी एलिगेंस के विकास, शरीर विज्ञान और जीवनकाल6 पर विविध प्रभाव डालता है। कई सामान्य प्रयोगशाला प्रथाएं ओपी 50 द्वारा उत्पादित पोषक तत्व संरचना और मेटाबोलाइट्स में इस तरह के परिवर्तन प्राप्त कर सकती हैं। विशेष रूप से, 5-फ्लोरो -2′-डीऑक्सीयूरिडीन (एफयूडीआर) के संपर्क में, एक यौगिक जो आमतौर पर सी एलिगेंस में प्रजनन को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है, ओपी 50 जीन अभिव्यक्ति में व्यापक परिवर्तन प्राप्त करता है, जिसमें अमीनो एसिड बायोसिंथेसिस मार्ग7 शामिल हैं। जीवित बैक्टीरिया उन अध्ययनों को भी भ्रमित कर सकते हैं जिनमें सी एलिगेंस को छोटे अणुओं के साथ पूरक किया जाता है क्योंकि बैक्टीरिया सक्रिय यौगिकों को आंशिक रूप से या पूरी तरह से चयापचय कर सकते हैं। इसके अलावा, बैक्टीरिया पर इन छोटे अणुओं के प्रभाव, बदले में, सी एलिगेंस फिजियोलॉजी को बदल सकते हैं, जैसा कि जीवनकाल-विस्तारित दवा मेटफॉर्मिन8 के साथ बताया गया था। अंत में, जीवित बैक्टीरिया कृमि के वातावरण को उन तरीकों से बदल सकते हैं जो व्यवहार को बदलते हैं, जैसे कि आकर्षक गंधकों को स्रावित करना9, बहिर्जात न्यूरोमोड्यूलेटर10 का उत्पादन करना, और घने बैक्टीरिया लॉन11 में ऑक्सीजन ग्रेडिएंट बनाना।
एलिगेंस अनुसंधान पर जीवाणु चयापचय के भ्रामक प्रभावों को कम करने के लिए, बैक्टीरिया को मारने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं (तालिका 1)। ओपी 50 को मारने के लिए तीन सामान्य रणनीतियां यूवी-विकिरण, गर्मी-हत्या और एंटीबायोटिक उपचार हैं। जबकि सीधा और अपेक्षाकृत कम लागत वाला, इनमें से प्रत्येक विधि बैक्टीरिया और सी एलिगेंस दोनों पर अवांछनीय प्रभाव डाल सकती है। यूवी क्रॉसलिंकर12 के माध्यम से यूवी-किलिंग कम-थ्रूपुट है और दर उन प्लेटों की संख्या से सीमित है जो यूवी क्रॉसलिंकर में फिट हो सकती हैं। इसके अलावा, यूवी-किलिंग की प्रभावकारिता एक बैच के भीतर प्लेट से प्लेट में भिन्न हो सकती है, और सभी प्लेटों पर विकास के लिए परीक्षण बड़े प्रयोगों में मुश्किल हो सकता है। >60 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर संस्कृति को उजागर करके हीट-किलिंग ओपी 50 चुनौतियों का एक अलग सेट आता है। उच्च गर्मी कीड़े के लिए आवश्यक पोषक तत्वों को नुकसान पहुंचा सकती है और बैक्टीरिया की सेलुलर संरचना को नष्ट कर सकती है, जिससे एक नरम बनावट बनती हैजो कीड़े को भोजन पर खर्च करने की मात्रा को कम करती है। एलिगेंस के पूरे जीवन चक्र में इस विधि का भी उपयोग नहीं किया जा सकता है क्योंकि गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया को खिलाए गए कीड़ेविकास में जल्दी गिरफ्तार हो सकते हैं। एंटीबायोटिक उपचार बैक्टीरिया चयापचय को दबाने के लिए एक तीसरी आम विधि है14, लेकिन एंटीबायोटिक्स कृमि वृद्धि और चयापचयको भी बदल सकते हैं।
बैक्टीरिया संरचना और आवश्यक पोषक तत्वों को संरक्षित करते हुए जीवित बैक्टीरिया के चयापचय प्रभाव को खत्म करने का एक समाधान पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) 16 के साथ ओपी 50 को मारना है। पीएफए फॉर्मलाडेहाइड का एक बहुलक है जो आंतरिक प्लाज्मा झिल्ली18 जैसी आंतरिक कोशिका संरचनाओं को नष्ट किए बिना बैक्टीरिया प्रतिकृति को रोकने के लिए कोशिकाओं17 के भीतर प्रोटीन को क्रॉसलिंक कर सकता है। आंतरिक सेलुलर संरचना के इस संरक्षण के कारण, पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया कोई विकास या चयापचय गतिविधि प्रदर्शित नहीं करते हैं, लेकिन सी एलिगेंस16 के लिए एक खाद्य और पोषक तत्वों से भरपूर खाद्य स्रोत बने रहते हैं। यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है जो दिखाता है कि पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करके बैक्टीरिया को चयापचय रूप से कैसे निष्क्रिय किया जाए।
| विधि | आवश्यक सामग्री | स्केलेबल? | पोषण संबंधी? | कीड़े पर प्रभाव? | ||||
| यूवी | यूवी-क्रॉसलिंकर | द्वारा सीमित: | हाँ | एनजीएम12, 23, 24 पर जीवनकाल पर परिवर्तनीय प्रभाव। | ||||
| यूवी-क्रॉसलिंकर में फिट होने वाली प्लेटों की संख्या | FUdR24, 26, 27 पर जीवनकाल पर परिवर्तनीय प्रभाव। | |||||||
| विकिरण समय प्रति प्लेट | भोजन वरीयता में कमी16 | |||||||
| विकास के लिए हर प्लेट की जांच करने की क्षमता8 | ||||||||
| गर्मी | >60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर | हाँ | नहीं: सेल की दीवार को नष्ट करता है, पोषण मूल्य में कमी आई है | विकासात्मक गिरफ्तारी 13 | ||||
| भोजन वरीयता में कमी13 | ||||||||
| एनजीएम31 पर जीवनकाल बढ़ाता है | ||||||||
| एंटीबायोटिक दवाओं | एंटीबायोटिक्स (कनामाइसिन, कार्बेनिसिलिन, आदि) | हाँ | हाँ | वृद्धि और विकास में देरी15 | ||||
| तरल मीडिया में जीवनकाल बढ़ाता है19 | ||||||||
| एनजीएम15 पर जीवनकाल बढ़ाता है | ||||||||
| पीएफए | 0.5% पैराफॉर्मलडिहाइड | हाँ | हाँ | छोटे ब्रूड आकारमें कमी 16 | ||||
| छोटे विकास समय में वृद्धि16 | ||||||||
| भोजन वरीयता में कमी16 | ||||||||
तालिका 1. ओपी 50 को मारने के तरीकों की तुलना। यूवी-किलिंग, हीट-किलिंग, एंटीबायोटिक-उपचार और पीएफए-उपचार का बैक्टीरिया की पोषण संबंधी स्थिति और उपचारित बैक्टीरिया को खिलाए गए कीड़े के स्वास्थ्य पर विभिन्न प्रभाव पड़ता है। ई कोलाई को निष्क्रिय करने के लिए ये विधियां उनकी आवश्यक सामग्री और स्केलेबिलिटी में भी भिन्न होती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
अन्य जीवाणु-हत्या विधियों के सापेक्ष पीएफए-हत्या के लाभ
पीएफए-उपचार सी एलिगेंस के लिए एक पौष्टिक भोजन स्रोत बनाए रखते हुए बैक्टीरिया चयापचय को रोकने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि है। पीएफए-उप…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच R21AG059117 और मिशिगन विश्वविद्यालय में एजिंग रिसर्च के जीवविज्ञान के लिए पॉल एफ ग्लेन प्रयोगशालाओं द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एसबी को T32AG000114 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। ईएसके को एनएसएफ डीजीई 1841052 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
Referências
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