Metodologia para Inativação Metabolicamente de Bactérias para Pesquisa de Caenorhabditis elegans

Resumo

A fonte de alimento para Caenorhabditis elegans no laboratório é Escherichia coli viva. Como as bactérias são metabolicamente ativas, elas apresentam uma variável de confusão em estudos metabólicos e de drogas em C. elegans. Um protocolo detalhado para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído é descrito aqui.

Resumo

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo comum para pesquisa em genética, desenvolvimento, envelhecimento, metabolismo e comportamento. Como C. elegans consomem uma dieta de bactérias vivas, a atividade metabólica de sua fonte alimentar pode confundir experimentos que procuram os efeitos diretos de várias intervenções sobre o verme. Para evitar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano, os pesquisadores de C. elegans usaram vários métodos para inativar metabolicamente as bactérias, incluindo irradiação ultravioleta (UV), morte por calor e antibióticos. O tratamento UV é relativamente baixo rendimento e não pode ser usado em cultura líquida porque cada placa deve ser examinada para matar bactérias com sucesso. Um segundo método de tratamento, o termo-matança, afeta negativamente a textura e a qualidade nutricional das bactérias, levando à parada do desenvolvimento de C. elegans. Finalmente, o tratamento com antibióticos pode alterar diretamente a fisiologia de C. elegans , além de prevenir o crescimento bacteriano. Este manuscrito descreve um método alternativo para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído (PFA). O tratamento com PFA faz ligações cruzadas de proteínas dentro das células bacterianas para prevenir a atividade metabólica, preservando a estrutura celular e o conteúdo nutricional. Este método é de alto rendimento e pode ser usado em cultura líquida ou placas sólidas, pois o teste de uma placa de bactérias tratadas com PFA para crescimento valida todo o lote. A inativação metabólica através do tratamento com PFA pode ser usada para eliminar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano em estudos de suplementação de drogas ou metabólitos, resistência ao estresse, metabolômica e comportamento em C. elegans.

Introdução

Caenorhabditis elegans foi originalmente proposto como organismo modelo em 1965¹ e desde então tem sido amplamente adotado em estudos de genética, desenvolvimento, comportamento, envelhecimento e metabolismo². Devido ao seu grande tamanho de ninhada e cutícula transparente, C. elegans é particularmente adequada para triagem de alto rendimento com repórteres fluorescentes³. Seu curto ciclo de vida, reprodução hermafrodita e homologia genética com humanos também fazem de C. elegans um valioso sistema modelo para estudos sobre o desenvolvimento⁴ e bi....

Protocolo

1. Inoculação de bactérias

1. Preparar o caldo Luria (LB) dissolvendo 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em 950 mL de água destilada.
2. Ajustar o pH do LB para 7,0 adicionando hidróxido de sódio (NaOH) 5M. Isso deve exigir apenas cerca de 0,2 mL de NaOH.
3. Autoclave o meio LB ajustado ao pH em um ciclo líquido por 45 min a 15 psi. Deixe a solução arrefecer e armazenar à temperatura ambiente.
4. Inocular uma única colônia de bactérias em 100 mL de LB em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL. Cultivar as bactérias durante a noite em uma incubadora de agitação a 37 °C.
5. Depend....

Resultados

Um fluxo de trabalho detalhado do protocolo é mostrado na Figura 1. Um método de alto rendimento foi desenvolvido e otimizado para inativar consistentemente a replicação bacteriana (Figura 2A) e o metabolismo (Figura 2B) para estudos metabólicos e de drogas em pesquisas de C. elegans usando paraformaldeído¹⁶. O objetivo era determinar a menor concentração de PFA necessária e o menor tempo necessário .......

Discussão

Benefícios da morte por PFA em relação a outros métodos de eliminação bacteriana
O tratamento com PFA é um método de alto rendimento para prevenir o metabolismo bacteriano, mantendo uma fonte de alimento nutritivo para C. elegans. Matar bactérias através do tratamento com PFA tem múltiplas vantagens sobre outros métodos. Ao contrário do tratamento UV, onde cada placa deve ser testada para matar com sucesso, uma única placa de um lote de bactérias tratadas com PFA pode ser testada para validar.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grampos	Folha de Alumínio	2549291
Bico de Bunsen	VWR	470121-700
Medidor de Densidade Celular	Denville	80-3000-45
Centrífuga	Eppendorg	5430
Capuz de fumaça química	Labcono	975050411384RG
Tubos conincais (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Frascos Erlenmyer	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Alça de inoculação	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Frasco de coleta de resíduos líquidos	Thomas Scientific	1230G50
Sulfato de Magnésio (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldeído (32%)	Ciências de Microscopia Eletrônica	15714-S	Paraformaldeído - solução livre de metanol
Pipetador	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Pratos de plástico (100 mm)	Fisher	FB0875712
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Kit de ensaio de fluxo extracelular e microplaca de cultura celular	Agilent	101085-004
Pipetas sorológicas (50 mL)	Incubadora Genesee Scientific	12-107
Shaker	Thermo	11 676 083
Cloreto de Sódio (NaCl)	Fisher	S640-3
Hidróxido de Sódio (NaOH)	Fisher	S318500
Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Balde de coleta de resíduos sólidos	M& M Industries	Balde Tradicional M1 de 5.0 Galões

de Triptona Balança de Pesagem Vortex Thermo 11676331 Vortex Genesee Scientific 20-251 C Goldenwall HZ10K6B Extrato de Levedura Genesee Scientific 20-255