Metodologia para Inativação Metabolicamente de Bactérias para Pesquisa de Caenorhabditis elegans
Summary
A fonte de alimento para Caenorhabditis elegans no laboratório é Escherichia coli viva. Como as bactérias são metabolicamente ativas, elas apresentam uma variável de confusão em estudos metabólicos e de drogas em C. elegans. Um protocolo detalhado para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído é descrito aqui.
Abstract
Caenorhabditis elegans é um organismo modelo comum para pesquisa em genética, desenvolvimento, envelhecimento, metabolismo e comportamento. Como C. elegans consomem uma dieta de bactérias vivas, a atividade metabólica de sua fonte alimentar pode confundir experimentos que procuram os efeitos diretos de várias intervenções sobre o verme. Para evitar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano, os pesquisadores de C. elegans usaram vários métodos para inativar metabolicamente as bactérias, incluindo irradiação ultravioleta (UV), morte por calor e antibióticos. O tratamento UV é relativamente baixo rendimento e não pode ser usado em cultura líquida porque cada placa deve ser examinada para matar bactérias com sucesso. Um segundo método de tratamento, o termo-matança, afeta negativamente a textura e a qualidade nutricional das bactérias, levando à parada do desenvolvimento de C. elegans. Finalmente, o tratamento com antibióticos pode alterar diretamente a fisiologia de C. elegans , além de prevenir o crescimento bacteriano. Este manuscrito descreve um método alternativo para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído (PFA). O tratamento com PFA faz ligações cruzadas de proteínas dentro das células bacterianas para prevenir a atividade metabólica, preservando a estrutura celular e o conteúdo nutricional. Este método é de alto rendimento e pode ser usado em cultura líquida ou placas sólidas, pois o teste de uma placa de bactérias tratadas com PFA para crescimento valida todo o lote. A inativação metabólica através do tratamento com PFA pode ser usada para eliminar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano em estudos de suplementação de drogas ou metabólitos, resistência ao estresse, metabolômica e comportamento em C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans foi originalmente proposto como organismo modelo em 19651 e desde então tem sido amplamente adotado em estudos de genética, desenvolvimento, comportamento, envelhecimento e metabolismo2. Devido ao seu grande tamanho de ninhada e cutícula transparente, C. elegans é particularmente adequada para triagem de alto rendimento com repórteres fluorescentes3. Seu curto ciclo de vida, reprodução hermafrodita e homologia genética com humanos também fazem de C. elegans um valioso sistema modelo para estudos sobre o desenvolvimento4 e biologia do envelhecimento5. Além disso, C. elegans são relativamente fáceis de manter. Os vermes podem ser cultivados em cultura líquida ou em placas sólidas de ágar e consumir uma dieta de bactérias vivas de Escherichia coli OP504.
No entanto, a fonte de alimento vivo de C. elegans pode confundir estudos de metabolismo, suplementação de drogas e comportamento. Como as bactérias vivas têm seu próprio metabolismo, as condições experimentais que afetam as bactérias também alteram os nutrientes e metabólitos disponíveis para os vermes. Por exemplo, diferenças nas concentrações bacterianas de ferro, aminoácidos e folato têm diversos efeitos sobre o desenvolvimento, fisiologia e vida útil de C. elegans 6. Muitas práticas comuns de laboratório podem provocar tais mudanças na composição de nutrientes e metabólitos produzidos pelo OP50. Especificamente, a exposição à 5-fluor-2′-desoxiuridina (FUdR), um composto comumente usado para prevenir a reprodução em C. elegans, provoca amplas alterações na expressão gênica do gene OP50, incluindo vias de biossíntese de aminoácidos7. Bactérias vivas também podem confundir estudos em que C. elegans são suplementados com pequenas moléculas porque as bactérias podem metabolizar parcial ou completamente os compostos ativos. Além disso, os efeitos dessas pequenas moléculas sobre as bactérias podem, por sua vez, alterar a fisiologia de C. elegans, como foi relatado com o fármaco que prolonga a vida útil da metformina8. Finalmente, bactérias vivas podem alterar o ambiente do verme de maneiras que alteram o comportamento, como secretar odorantes atraentes9, produzir neuromoduladores exógenos10 e criar gradientes de oxigênio em um gramado bacteriano denso11.
Para atenuar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano na pesquisa de C. elegans , vários métodos para matar bactérias foram desenvolvidos (Tabela 1). Três estratégias comuns para matar OP50 são irradiação UV, morte por calor e tratamento com antibióticos. Embora simples e relativamente de baixo custo, cada um desses métodos pode ter efeitos indesejáveis sobre bactérias e C. elegans. A eliminação por UV através de um reticulador UV12 é de baixo rendimento e a taxa é limitada pelo número de placas que podem caber no reticulante UV. Além disso, a eficácia da eliminação por UV pode variar de placa para placa dentro de um lote, e o teste de crescimento em todas as placas pode se tornar difícil em grandes experimentos. Matar o calor OP50 expondo a cultura a temperaturas de >60 °C vem com um conjunto separado de desafios. O calor elevado pode danificar nutrientes essenciais para o verme e destruir a estrutura celular das bactérias, criando uma textura mais macia que diminui a quantidade de tempo que os vermes passam no alimento13. Este método também não pode ser usado durante todo o ciclo de vida de C. elegans , pois vermes alimentados com bactérias mortas pelo calor podem parar no início do desenvolvimento13. O tratamento com antibióticos é um terceiro método comum para suprimir o metabolismo bacteriano14, mas os antibióticos também podem alterar o crescimento e o metabolismo do verme15.
Uma solução para eliminar os efeitos metabólicos de bactérias vivas, preservando a estrutura bacteriana e nutrientes essenciais, é matar a OP50 com paraformaldeído (PFA)16. O PFA é um polímero de formaldeído que pode fazer ligações cruzadas entre proteínas dentro das células17 para impedir a replicação bacteriana sem destruir estruturas celulares internas, como a membrana plasmática interna18. Devido a essa preservação da estrutura celular interna, as bactérias tratadas com PFA não exibem crescimento ou atividade metabólica, mas permanecem como fonte alimentar comestível e rica em nutrientes para C. elegans16. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido que mostra como inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído.
| Método | Materiais necessários | Escalonável? | Nutricional? | Efeitos sobre o verme? | ||||
| UV | Reticulante UV | Limitado por: | Sim | Efeitos variáveis na vida útil de NGM12, 23, 24 | ||||
| Número de placas que se encaixam no reticulante UV | Efeitos variáveis na vida útil do FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Tempo de irradiação por placa | Diminuição da preferência alimentar16 | |||||||
| Capacidade de verificar o crescimento de cada placa8 | ||||||||
| Calor | Incubadora >60 °C | Sim | Não: destrói a parede celular, diminuição do valor nutricional | Prisão preventiva 13 | ||||
| Diminuição da preferência alimentar13 | ||||||||
| Prolonga a vida útil no NGM31 | ||||||||
| Antibióticos | Antibióticos (canamicina, carbenicilina, etc.) | Sim | Sim | Atrasa o crescimento e o desenvolvimento15 | ||||
| Prolonga a vida útil em meios líquidos19 | ||||||||
| Prolonga a vida útil no NGM15 | ||||||||
| PFA | 0,5% Paraformaldeído | Sim | Sim | Diminuição do tamanho da ninhadapequena 16 | ||||
| Aumento do tempo de desenvolvimentopequeno 16 | ||||||||
| Diminuição da preferência alimentar16 | ||||||||
Tabela 1. Comparações de métodos para matar OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotico-treatment, e PFA-treatment têm efeitos variados sobre o estado nutricional das bactérias e a saúde dos vermes alimentados com bactérias tratadas. Esses métodos para inativar replicativamente E. coli também diferem em seus materiais necessários e escalabilidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Benefícios da morte por PFA em relação a outros métodos de eliminação bacteriana
O tratamento com PFA é um método de alto rendimento para prevenir o metabolismo bacteriano, mantendo uma fonte de alimento nutritivo para C. elegans. Matar bactérias através do tratamento com PFA tem múltiplas vantagens sobre outros métodos. Ao contrário do tratamento UV, onde cada placa deve ser testada para matar com sucesso, uma única placa de um lote de bactérias tratadas com PFA pode ser testa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH R21AG059117 e pelo Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research da Universidade de Michigan. O SB foi financiado pela T32AG000114. O ESK foi financiado pela NSF DGE 1841052.
Materials
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
Referências
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