Vi gir en omfattende oversikt og forbedring av eksisterende protokoller for organoiddannelse av hepatocellulært karsinom (HCC), som omfatter alle stadier av organoiddyrking. Dette systemet fungerer som en verdifull modell for identifisering av potensielle terapeutiske mål og vurdering av legemiddelkandidateffektivitet.
Hepatocellulært karsinom (HCC) er en svært utbredt og dødelig svulst over hele verden, og dens sene oppdagelse og mangel på effektive spesifikke terapeutiske midler nødvendiggjør videre forskning på patogenesen og behandlingen. Organoider, en ny modell som ligner innfødt tumorvev og kan dyrkes in vitro, har fått betydelig interesse de siste årene, med mange rapporter om utvikling av organoidmodeller for leverkreft. I denne studien har vi lykkes med å optimalisere prosedyren og etablert en kulturprotokoll som muliggjør dannelse av større HCC-organoider med stabile passasje- og kulturforhold. Vi har omfattende skissert hvert trinn i prosedyren, som dekker hele prosessen med HCC-vevsdissosiasjon, organoid plating, kultur, passaging, kryopreservering og gjenopplivning, og gitt detaljerte forholdsregler i dette papiret. Disse organoider utviser genetisk likhet med det opprinnelige HCC-vevet og kan brukes til forskjellige applikasjoner, inkludert identifisering av potensielle terapeutiske mål for svulster og påfølgende legemiddelutvikling.
Hepatocellulært karsinom (HCC), en utbredt og omfattende mangfoldig svulst1, har fått betydelig oppmerksomhet i det medisinske samfunnet. Tilstedeværelsen av avstamningsplastisitet og betydelig heterogenitet i HCC antyder at tumorceller som stammer fra forskjellige pasienter og til og med forskjellige lesjoner hos samme pasient, kan manifestere forskjellige molekylære og fenotypiske egenskaper, og dermed presentere formidable hindringer i utviklingen av innovative terapeutiske tilnærminger 2,3,4,5 . Det er derfor et tvingende behov for økt forståelse av de biologiske egenskapene og mekanismene for legemiddelresistens i HCC for å informere formuleringen av mer effektive behandlingsstrategier.
I de siste tiårene har forskere dedikert sin innsats til utvikling av in vitro-modeller med det formål å studere HCC 3,4. Til tross for noen fremskritt, fortsetter begrensningene. Disse modellene omfatter en rekke teknikker, for eksempel bruk av cellelinjer, primære celler og pasientavledede xenotransplantater (PDX). Cellelinjer fungerer som in vitro-modeller for langsiktig kultur av tumorceller oppnådd fra HCC-pasienter, og tilbyr fordelene med bekvemmelighet og lett ekspansjon. Primære cellemodeller involverer direkte isolasjon og kultur av primære tumorceller fra pasientens tumorvev, og gir dermed en representasjon av biologiske egenskaper som ligner pasientene selv. PDX-modeller innebærer transplantasjon av pasientens tumorvev i mus, med sikte på mer trofast å simulere tumorvekst og respons. Disse modellene har vært medvirkende til HCC-forskning, men de har visse begrensninger, inkludert heterogeniteten til cellelinjer og manglende evne til å replikere in vivo-forhold fullt ut. Videre kan langvarig in vitro-dyrking føre til forringelse av cellenes opprinnelige egenskaper og funksjon, noe som gir utfordringer med å nøyaktig representere de biologiske egenskapene til HCC. I tillegg er bruken av PDX-modeller både tidkrevende og kostbar3.
For å løse disse begrensningene og mer nøyaktig replikere de fysiologiske egenskapene til HCC, har bruken av organoidteknologi blitt introdusert som en lovende forskningsplattform som er i stand til å overgå tidligere begrensninger. Organoider, som er tredimensjonale cellemodeller dyrket in vitro, har evnen til å replikere strukturen og funksjonaliteten til faktiske organer. I HCC-sammenheng eksisterer det imidlertid visse utfordringer med å etablere organoide modeller. Disse utfordringene inkluderer utilstrekkelig detaljerte beskrivelser av HCC-organoidkonstruksjonsprosedyrer, mangel på omfattende protokoller for hele prosessen med HCC-organoidkonstruksjon, og den typisk lille størrelsen på dyrkede organoider 6,7,8. I lys av de typisk begrensede dimensjonene av dyrkede organoider, forsøkte vi å takle disse utfordringene gjennom utviklingen av en omfattende protokoll som omfatter hele HCC-organoidkonstruksjonen6. Denne protokollen omfatter vevsdissosiasjon, organoid plating, kultur, passasje, kryopreservering og gjenopplivning. Ved å optimalisere de prosessuelle trinnene og raffinere sammensetningen av kulturmediet, har vi lykkes med å etablere HCC-organoidmodeller som er i stand til vedvarende vekst og langsiktig passasje 6,8. I de påfølgende avsnittene vil en omfattende redegjørelse for de operasjonelle vanskelighetene og relevante faktorer involvert i konstruksjonen av HCC-organoider bli presentert.
En bemerkelsesverdig fordel med pasientavledede organoidmodeller ligger i deres evne til trofast å replikere de biologiske egenskapene til svulster, som omfatter vevstruktur og genomisk landskap. Disse modellene viser et bemerkelsesverdig nivå av nøyaktighet og speiler effektivt heterogeniteten og progresjonen av svulster, selv over lengre perioder med dyrking 6,8,9. Gjennom bruken av denne raffinerte organoidkulturprotokolle…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) og Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).
[Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
DAPT | Merck | D5942 | |
Dexamethasone | Merck | D4902 | |
DMSO | Merck | C6164 | |
DNaseI | Merck | DN25 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
Forceps | N/A | N/A | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
Nicotinamide | Merck | N0636 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Surgical scissors | N/A | N/A | |
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
TNFα | Peprotech | 315-01A | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |