Utvikling og optimalisering av en human hepatocellulært karsinom pasientavledet organoidmodell for potensiell målidentifikasjon og legemiddeloppdagelse

Summary

Vi gir en omfattende oversikt og forbedring av eksisterende protokoller for organoiddannelse av hepatocellulært karsinom (HCC), som omfatter alle stadier av organoiddyrking. Dette systemet fungerer som en verdifull modell for identifisering av potensielle terapeutiske mål og vurdering av legemiddelkandidateffektivitet.

Abstract

Hepatocellulært karsinom (HCC) er en svært utbredt og dødelig svulst over hele verden, og dens sene oppdagelse og mangel på effektive spesifikke terapeutiske midler nødvendiggjør videre forskning på patogenesen og behandlingen. Organoider, en ny modell som ligner innfødt tumorvev og kan dyrkes in vitro, har fått betydelig interesse de siste årene, med mange rapporter om utvikling av organoidmodeller for leverkreft. I denne studien har vi lykkes med å optimalisere prosedyren og etablert en kulturprotokoll som muliggjør dannelse av større HCC-organoider med stabile passasje- og kulturforhold. Vi har omfattende skissert hvert trinn i prosedyren, som dekker hele prosessen med HCC-vevsdissosiasjon, organoid plating, kultur, passaging, kryopreservering og gjenopplivning, og gitt detaljerte forholdsregler i dette papiret. Disse organoider utviser genetisk likhet med det opprinnelige HCC-vevet og kan brukes til forskjellige applikasjoner, inkludert identifisering av potensielle terapeutiske mål for svulster og påfølgende legemiddelutvikling.

Introduction

Hepatocellulært karsinom (HCC), en utbredt og omfattende mangfoldig svulst¹, har fått betydelig oppmerksomhet i det medisinske samfunnet. Tilstedeværelsen av avstamningsplastisitet og betydelig heterogenitet i HCC antyder at tumorceller som stammer fra forskjellige pasienter og til og med forskjellige lesjoner hos samme pasient, kan manifestere forskjellige molekylære og fenotypiske egenskaper, og dermed presentere formidable hindringer i utviklingen av innovative terapeutiske tilnærminger 2,3,4,5 . Det er derfor et tvingende behov for økt forståelse av de biologiske egenskapene og mekanismene for legemiddelresistens i HCC for å informere formuleringen av mer effektive behandlingsstrategier.

I de siste tiårene har forskere dedikert sin innsats til utvikling av in vitro-modeller med det formål å studere HCC ^3,4. Til tross for noen fremskritt, fortsetter begrensningene. Disse modellene omfatter en rekke teknikker, for eksempel bruk av cellelinjer, primære celler og pasientavledede xenotransplantater (PDX). Cellelinjer fungerer som in vitro-modeller for langsiktig kultur av tumorceller oppnådd fra HCC-pasienter, og tilbyr fordelene med bekvemmelighet og lett ekspansjon. Primære cellemodeller involverer direkte isolasjon og kultur av primære tumorceller fra pasientens tumorvev, og gir dermed en representasjon av biologiske egenskaper som ligner pasientene selv. PDX-modeller innebærer transplantasjon av pasientens tumorvev i mus, med sikte på mer trofast å simulere tumorvekst og respons. Disse modellene har vært medvirkende til HCC-forskning, men de har visse begrensninger, inkludert heterogeniteten til cellelinjer og manglende evne til å replikere in vivo-forhold fullt ut. Videre kan langvarig in vitro-dyrking føre til forringelse av cellenes opprinnelige egenskaper og funksjon, noe som gir utfordringer med å nøyaktig representere de biologiske egenskapene til HCC. I tillegg er bruken av PDX-modeller både tidkrevende og kostbar³.

For å løse disse begrensningene og mer nøyaktig replikere de fysiologiske egenskapene til HCC, har bruken av organoidteknologi blitt introdusert som en lovende forskningsplattform som er i stand til å overgå tidligere begrensninger. Organoider, som er tredimensjonale cellemodeller dyrket in vitro, har evnen til å replikere strukturen og funksjonaliteten til faktiske organer. I HCC-sammenheng eksisterer det imidlertid visse utfordringer med å etablere organoide modeller. Disse utfordringene inkluderer utilstrekkelig detaljerte beskrivelser av HCC-organoidkonstruksjonsprosedyrer, mangel på omfattende protokoller for hele prosessen med HCC-organoidkonstruksjon, og den typisk lille størrelsen på dyrkede organoider ^6,7,8. I lys av de typisk begrensede dimensjonene av dyrkede organoider, forsøkte vi å takle disse utfordringene gjennom utviklingen av en omfattende protokoll som omfatter hele HCC-organoidkonstruksjonen⁶. Denne protokollen omfatter vevsdissosiasjon, organoid plating, kultur, passasje, kryopreservering og gjenopplivning. Ved å optimalisere de prosessuelle trinnene og raffinere sammensetningen av kulturmediet, har vi lykkes med å etablere HCC-organoidmodeller som er i stand til vedvarende vekst og langsiktig passasje ^6,8. I de påfølgende avsnittene vil en omfattende redegjørelse for de operasjonelle vanskelighetene og relevante faktorer involvert i konstruksjonen av HCC-organoider bli presentert.

Protocol

Humanbiopsert vev ble innhentet fra den respektive pasienten ved Affiliated Cancer Hospital og Institute of Guangzhou Medical University, og informert samtykke ble innhentet fra pasientene. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen. 1. Etablering av pasientavledede HCC-organoider fra kirurgiske prøver MERK: Etableringen av HCC-organoider omfatter ulike stadier, n…

Representative Results

Ved implementering av ovennevnte prosedyre kan fremveksten av HCC-organoide sfæroider typisk observeres i løpet av 3 dager (figur 1). Figur 1A,B viser det etablerte HCC-organoidet, som raskt utvikler kompakte sfæroider preget av avrundede kanter og permeabel cytosol på den første etableringsdagen. Under veksten av HCC-organoider hadde bruken av forskjellige konsentrasjoner av BME forskjellige effekter på organoidernes veksthastighet. Vi dy…

Discussion

En bemerkelsesverdig fordel med pasientavledede organoidmodeller ligger i deres evne til trofast å replikere de biologiske egenskapene til svulster, som omfatter vevstruktur og genomisk landskap. Disse modellene viser et bemerkelsesverdig nivå av nøyaktighet og speiler effektivt heterogeniteten og progresjonen av svulster, selv over lengre perioder med dyrking ^6,8,9. Gjennom bruken av denne raffinerte organoidkulturprotokolle…

Materials

[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines