Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

Elena Levi-D’Ancona; Vaibhav Sidarala; Scott A. Soleimanpour

doi:10.3791/65789

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Artigo de método

Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

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DOI:

10.3791/65789

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15 de setembro de 2023

Elena Levi-D’Ancona¹^,² , Vaibhav Sidarala¹ , Scott A. Soleimanpour¹^,³^,⁴

¹Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, ²Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, ³Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴VA Ann Arbor Healthcare System

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve dois métodos para a análise quantitativa da mitofagia em células β pancreáticas: primeiro, uma combinação de corantes específicos para mitocôndrias permeáveis a células e, segundo, um repórter de mitofagia codificado geneticamente. Essas duas técnicas são complementares e podem ser empregadas com base em necessidades específicas, permitindo flexibilidade e precisão na abordagem quantitativa do controle de qualidade mitocondrial.

Resumo

A mitofagia é um mecanismo de controle de qualidade necessário para manter a função mitocondrial ideal. A mitofagia disfuncional de células β resulta em liberação insuficiente de insulina. Avaliações quantitativas avançadas de mitofagia geralmente requerem o uso de repórteres genéticos. O modelo de camundongo mt-Keima, que expressa uma sonda de dupla excitação sensível ao pH para quantificar a mitofagia via citometria de fluxo, foi otimizado em células β. A razão entre as emissões de comprimento de onda mt-Keima ácido-neutro pode ser usada para quantificar robustamente a mitofagia. No entanto, o uso de mitofagia genética pode ser um desafio ao trabalhar com modelos genéticos complexos de camundongos ou células difíceis de transfectar, como ilhotas humanas primárias. Este protocolo descreve um novo método complementar baseado em corantes para quantificar a mitofagia de células β em ilhotas primárias usando MtPhagy. A MtPhagy é um corante celular sensível ao pH que se acumula nas mitocôndrias e aumenta sua intensidade de fluorescência quando as mitocôndrias estão em ambientes de pH baixo, como os lisossomos durante a mitofagia. Combinando o corante MtPhagy com Fluozin-3-AM, um indicador de Zn²⁺ que seleciona para células β, e Tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE) para avaliar o potencial de membrana mitocondrial, o fluxo de mitofagia pode ser quantificado especificamente em células β via citometria de fluxo. Essas duas abordagens são altamente complementares, permitindo flexibilidade e precisão na avaliação do controle de qualidade mitocondrial em inúmeros modelos de células β.

Introdução

As células β pancreáticas produzem e secretam insulina para atender às demandas metabólicas, e a disfunção das células β é responsável pela hiperglicemia e pelo aparecimento de diabetes tanto no diabetes tipo 1 quanto no tipo 2. As células β acoplam o metabolismo da glicose à secreção de insulina via produção energética e metabólica mitocondrial, que dependem de uma reserva de massa mitocondrial funcional ^1,2,3. Para manter a função ótima das células β, as células β dependem de mecanismos de controle de qualidade mitocondrial para remover mitocôndrias envelhecidas ou danifica....