Enfoques complementarios para interrogar el flujo de mitofagia en las células β pancreáticas

Summary

Este protocolo describe dos métodos para el análisis cuantitativo de la mitofagia en las células β pancreáticas: en primer lugar, una combinación de colorantes específicos de mitocondrias permeables a las células y, en segundo lugar, un indicador de mitofagia codificado genéticamente. Estas dos técnicas son complementarias y pueden implementarse en función de necesidades específicas, lo que permite flexibilidad y precisión para abordar cuantitativamente el control de calidad mitocondrial.

Abstract

La mitofagia es un mecanismo de control de calidad necesario para mantener una función mitocondrial óptima. La mitofagia disfuncional de las células β da como resultado una liberación insuficiente de insulina. Las evaluaciones cuantitativas avanzadas de la mitofagia a menudo requieren el uso de indicadores genéticos. El modelo de ratón mt-Keima, que expresa una sonda radiométrica de doble excitación sensible al pH dirigida a las mitocondrias para cuantificar la mitofagia mediante citometría de flujo, se ha optimizado en células β. La relación entre las emisiones de longitud de onda de mt-Keima ácidas y neutras se puede utilizar para cuantificar de forma robusta la mitofagia. Sin embargo, el uso de reporteros genéticos de mitofagia puede ser un desafío cuando se trabaja con modelos genéticos complejos de ratones o células difíciles de transfectar, como los islotes humanos primarios. Este protocolo describe un nuevo método complementario basado en colorantes para cuantificar la mitofagia de células β en islotes primarios mediante MtPhagy. MtPhagy es un colorante sensible al pH y permeable a las células que se acumula en las mitocondrias y aumenta su intensidad de fluorescencia cuando las mitocondrias se encuentran en entornos de pH bajo, como los lisosomas durante la mitofagia. Al combinar el colorante MtPhagy con Fluozin-3-AM, un indicador de Zn²⁺ que selecciona para las células β, y tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE) para evaluar el potencial de la membrana mitocondrial, el flujo de mitofagia se puede cuantificar específicamente en las células β mediante citometría de flujo. Estos dos enfoques son altamente complementarios, lo que permite flexibilidad y precisión en la evaluación del control de calidad mitocondrial en numerosos modelos de células β.

Introduction

Las células β pancreáticas producen y secretan insulina para satisfacer las demandas metabólicas, y la disfunción de las células β es responsable de la hiperglucemia y la aparición de diabetes tanto en la diabetes tipo 1 como en la diabetes tipo 2. Las células β acoplan el metabolismo de la glucosa con la secreción de insulina a través de la energía mitocondrial y la producción metabólica, que dependen de una reserva de masa mitocondrial funcional ^1,2,3. Para mantener una función óptima de las células β, las células β dependen de los mecanismos de control de calidad mitocondrial para eliminar las mitocondrias envejecidas o dañadas y preservar^{la masa} mitocondrial funcional. La autofagia mitocondrial selectiva, también conocida como mitofagia, es un componente clave de la vía de control de calidad mitocondrial.

Las evaluaciones de la mitofagia en células vivas a menudo se basan en los cambios en el pH mitocondrial que ocurren durante la mitofagia. Las mitocondrias tienen un pH ligeramente alcalino, y las mitocondrias sanas normalmente residen en el citosol de pH neutro. Durante la mitofagia, las mitocondrias dañadas o disfuncionales se incorporan selectivamente a los autofagosomas y, finalmente, se eliminan dentro de los lisosomas ácidos⁵. Varios modelos de ratones reporteros de mitofagia transgénica in vivo, como mt-Keima⁶, mitoQC⁷ y CMMR⁸, así como sondas de mitofagia transfectables, como el plásmido Cox8-EGFP-mCherry⁹, utilizan este cambio de pH para proporcionar evaluaciones cuantitativas de la mitofagia. El uso de ratones transgénicos que expresan la sonda radiométrica de doble excitación sensible al pH mt-Keima se ha optimizado para las evaluaciones de mitofagia en islotes y células β mediante citometría de flujo^10,11. La relación entre las emisiones de longitud de onda mt-Keima ácidas y neutras (la relación entre la excitación ácida de 561 nm y la neutra de 480 nm) puede utilizarse para cuantificar de forma robusta la mitofagia ^6,12.

Este protocolo describe un enfoque optimizado para evaluar el flujo mitofagia en islotes primarios y células β aisladas de ratones transgénicos mt-Keima^10,11. Si bien mt-Keima es una sonda altamente sensible, requiere complicados esquemas de cría de animales o la transfección de células, lo que a menudo puede ser un desafío cuando se trabaja en combinación con otros modelos genéticos o con islotes humanos primarios. Además, el uso de múltiples láseres y detectores de fluorescencia para identificar poblaciones celulares neutras y ácidas puede limitar el uso combinatorio de otros reporteros fluorescentes.

Para superar estos desafíos, este protocolo también describe un método complementario, basado en colorantes de un solo canal fluorescente, para la detección robusta de mitofagia en células β de islotes de ratón aislados. Este enfoque, conocido como el método MtPhagy, utiliza una combinación de tres colorantes permeables a las células para seleccionar las células β, cuantificar las poblaciones celulares que se someten activamente a la mitofagia y evaluar el potencial de membrana mitocondrial (MMP o Δψm) simultáneamente.

El primero de estos colorantes es Fluozin-3-AM, un indicador de Zn²⁺ permeable a las células con un Ex/Em 494/516 nm¹³. Los islotes de ratón comprenden una población heterogénea de células funcionalmente distintas, incluidas las células α, β, δ y PP. Las células β comprenden aproximadamente el 80% de las células dentro del islote de ratón y se pueden distinguir de otros tipos de células de islotes debido a su alta concentración de Zn²⁺ dentro de los gránulos de insulina^14,15, lo que permite la identificación de las células β como la^alta población de Fluozin-3-AM. El colorante MtPhagy, un colorante sensible al pH que se inmoviliza en las mitocondrias a través de un enlace químico y emite fluorescencia débil, también se utiliza en este protocolo¹⁶. Tras la inducción de la mitofagia, las mitocondrias dañadas se incorporan al lisosoma ácido, y el colorante MtPhagy aumenta su intensidad de fluorescencia en el entorno de pH bajo (Ex/Em 561/570-700 nm).

Además, la tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE), se utiliza para evaluar la MMP. TMRE es un colorante permeable a las células con carga positiva (Ex/Em 552/575 nm) que es secuestrado por las mitocondrias sanas debido a la carga negativa relativa sostenida por su potencial de membrana¹⁷. Las mitocondrias dañadas o poco saludables disipan su potencial de membrana, lo que resulta en una disminución de la capacidad para secuestrar TMRE. Utilizando estos colorantes juntos, las células de β que se someten a mitofagia se pueden identificar como la población^altade Fluozin MtPhagy^altaTMRE^baja a través de la citometría de flujo. Dado que la mitofagia es un proceso dinámico y no estático, este protocolo se optimizó para evaluar el flujo de mitofagia utilizando valinomicina, un ionóforo de K⁺ que induce la mitofagia después de la disipación de MMP¹⁸. La comparación de la mitofagia en presencia y ausencia de valinomicina permite evaluar el flujo de mitofagia en diferentes grupos de muestras.

La naturaleza basada en colorantes del enfoque actual permite extrapolarlo a islotes humanos y otros tipos de células difíciles de transfectar y evita la necesidad de complicados esquemas de cría de animales, a diferencia del protocolo mt-Keima. El objetivo general de este protocolo es cuantificar la mitofagia en células β a nivel de una sola célula a través de dos métodos independientes basados en citometría de flujo. En conjunto, este protocolo describe dos métodos potentes y complementarios que permiten tanto precisión como flexibilidad en el estudio cuantitativo del control de calidad mitocondrial.

Protocol

Los estudios en animales presentados en este protocolo fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Para este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de veinte semanas de edad, ya sea con una dieta regular de grasas (RFD) de 15 semanas o una dieta alta en grasas (HFD). 1. Evaluación de la mitofagia a través del enfoque MtPhagy basado en colorantes (Método 1) Preparación y tratamiento d…

Representative Results

Evaluación de la mitofagia a través del enfoque MtPhagy basado en colorantesEste enfoque basado en colorantes se optimizó para analizar el flujo de mitofagia dentro de las células primarias de ratón β sin la necesidad de un reportero genético, utilizando Fluozin-3-AM, TMRE y MtPhagy, así como DAPI para excluir las células muertas. Al combinar estos colorantes con valinomicina para inducir la mitofagia, este protocolo describe un método basado en colorantes para medir selectivamente el flujo…

Discussion

Este protocolo describe dos métodos complementarios para cuantificar el flujo mitofagia en islotes primarios disociados de ratón. Utilizando el método mt-Keima, un aumento en la mitofagia se cuantificó como un aumento de la proporción de células ácidas (561 nm)/neutras (405 nm), mientras que en el método MtPhagy, el aumento del flujo de mitofagia se cuantificó como un aumento en la población de células^bajas de Fluozin^altaMtPhagy^altaTMRE. Estos métodos permiten realizar evaluac…

Materials

Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.