Dit artikel beschrijft een protocol voor diatomeeën-DNA-extractie met behulp van een aangepaste gemeenschappelijke DNA-extractiekit.
Diatomeeënonderzoek is een essentieel hulpmiddel in de forensische praktijk om te bepalen of het lijk in water is verdronken en om de verdrinkingslocatie af te leiden. Diatomeeëntesten is ook een belangrijke onderzoeksinhoud op het gebied van milieu en plankton. De diatomeeën moleculair biologische testtechnologie, die zich richt op diatomeeën-DNA als primair onderzoeksobject, is een nieuwe methode voor het testen van diatomeeën. Diatomeeën-DNA-extractie is de basis van moleculair testen van diatomeeën. Op dit moment zijn de kits die vaak worden gebruikt voor diatomeeën-DNA-extractie duur, wat de kosten van het uitvoeren van gerelateerd onderzoek verhoogt. Ons laboratorium verbeterde de algemene volbloed genomische DNA-snelextractiekit en verkreeg een bevredigend diatomeeën-DNA-extractie-effect, waardoor een alternatieve economische en betaalbare DNA-extractieoplossing wordt geboden op basis van glasparels voor gerelateerd onderzoek. Het diatomeeën-DNA dat met behulp van dit protocol wordt geëxtraheerd, zou kunnen voldoen aan veel stroomafwaartse toepassingen, zoals PCR en sequencing.
In de forensische praktijk is het essentieel voor de goede afwikkeling vande zaak om vast te stellen of een lijk dat in het water is gevonden, te verdrinken of na de dood in het water is gegooid. Het is ook een van de moeilijke kwesties die dringend moeten worden opgelost in de forensische praktijk2. Diatomeeën zijn overvloedig aanwezig in de natuurlijke omgeving (vooral in water)3,4. Tijdens het verdrinkingsproces, als gevolg van hypoxie en stressreactie, zullen mensen intense ademhalingsbewegingen hebben en een grote hoeveelheid verdrinkingsvloeistof inademen. Daarom komen de diatomeeën in het water de longen binnen met de verdrinkingsvloeistof, en sommige diatomeeën kunnen via de alveolair-capillaire barrière in de bloedcirculatie terechtkomen en zich verspreiden naar inwendige organen met de bloedstroom 5,6. De detectie van diatomeeën in inwendige weefsels en organen zoals longen, lever en beenmerg is een sterk bewijs van verdrinking voor de dood 7,8. Momenteel is forensisch diatomeeënonderzoek voornamelijk gebaseerd op morfologische testmethoden. Na een reeks voorvertering van het weefsel worden de morfologische kwalitatieve en kwantitatieve schattingen van onverteerde diatomeeën onder de microscoop uitgevoerd. Gedurende deze periode moeten gevaarlijke en milieuonvriendelijke reagentia zoals salpeterzuur worden gebruikt. Dit proces is tijdrovend en vereist dat onderzoekers beschikken over solide taxonomische expertise en uitgebreide ervaring. Dit alles brengt bepaalde uitdagingen met zich mee voor het forensisch personeel9. Diatomeeën-DNA-testtechnologie is een nieuwe technologie voor diatomeeëntesten die de afgelopen jaren is ontwikkeld 10,11,12. Deze technologie realiseert de soortidentificatie van diatomeeën door de specifieke DNA-sequentiesamenstelling van diatomeeënte analyseren 13,14. PCR-technologie en sequencing-technologie zijn veelgebruikte technische methoden, maar hun basis is de succesvolle extractie van DNA uit diatomeeën. Diatomeeën hebben echter een speciale structuur die verschilt van andere organismen, waardoor hun DNA-extractietechnieken ook anders zijn.
De celwand van diatomeeën heeft een hoge mate van verkiezeling en het hoofdbestanddeel is siliciumdioxide 15,16,17. De kiezelcelwand is erg hard en moet worden vernietigd voordat het DNA wordt geëxtraheerd. Gewone DNA-extractiekits zijn vaak moeilijk direct te gebruiken voor de extractie van diatomeeën-DNA, omdat ze de kiezelhoudende schil van diatomeeën niet kunnen vernietigen18. Daarom is het vernietigen van de kiezelhoudende schil van diatomeeën een van de belangrijkste technische problemen die moeten worden opgelost bij het extraheren van diatomeeën-DNA.
Tegelijkertijd, aangezien het aantal diatomeeën in forensische onderzoeksmonsters, of het nu gaat om watermonsters of organen en weefsels van verdronken lichamen, vaak beperkt is, is het noodzakelijk om diatomeeën te verrijken. De essentie van verrijking is het scheiden van stoffen. Terwijl u diatomeeën probeert te verzamelen, minimaliseert u het gehalte aan andere materiële componenten (storende componenten). Bij forensisch werk gebruiken laboratoria vaak centrifugatie- of membraanfiltratieverrijkingsmethoden om diatomeeëncellen te scheiden19. Omdat vacuümpompapparatuur echter niet veel wordt gebruikt, wordt de membraanverrijkingsmethode niet vaak gebruikt in gewone primaire forensische laboratoria. De centrifugatiemethode is dus nog steeds gebruikelijk diatomeeënverrijking in forensische laboratoria20.
DNA-extractie uit diatomeeën wordt momenteel voornamelijk gebruikt in de forensische praktijk en er zijn aanzienlijke beperkingen aan de toepassing ervan. Op dit moment zijn er maar weinig diatomeeën-DNA-extractiekits op de markt die in de forensische wetenschap worden gebruikt en ze zijn over het algemeen duur21. Dit artikel biedt een verbeterde diatomeeën-DNA-extractiemethode, waardoor diatomeeën-DNA-extractie eenvoudig, handig en kosteneffectief wordt. Dit verhoogt de toepassing van latere moleculair-biologische tests van diatomeeën en kan problemen met betrekking tot verdrinking in de forensische geneeskunde beter oplossen door middel van diatomeeëntesten. Deze methode breekt de kiezelhoudende celwanden van diatomeeën door glasparels toe te voegen en een geschikte tijd voor vortex in te stellen. Op deze manier lyseren het proteïnase K en de bindingsoplossing de cellen snel en inactiveren ze verschillende enzymen in de cellen. Het genomische DNA wordt geabsorbeerd in het matrixmembraan in de adsorptiekolom en uiteindelijk geëlueerd door de elutiebuffer. Zo’n verbeterde volbloed genextractiekit verbetert het diatomeeën-DNA-extractie-effect van de bloedkit in forensisch onderzoeksmateriaal, verlaagt de kosten van diatomeeën-DNA-extractie in de forensische praktijk en kan beter worden toegepast op forensisch onderzoek aan de basis.
Diatomeeëncellen worden beschermd door harde kiezelhoudende celwanden17, en deze structuur moet worden vernietigd om diatomeeën-DNA te extraheren. Gewone kits vernietigen niet gemakkelijk de kiezelhoudende schil van diatomeeën; dus het is moeilijk om diatomeeën-DNA21 met succes te extraheren. Ons laboratorium verbeterde de meest gebruikte bloed-DNA-extractiekit door glasparels met verschillende diameters en verschillende massaverhoudingen toe te voegen tijdens het proce…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) en door het Academician Innovation Platform Scientific Research Project van de provincie Hainan (YSPTZX202134).
Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |