Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die DNA-Extraktion von Kieselalgen unter Verwendung eines modifizierten gemeinsamen DNA-Extraktionskits.
Abstract
Die Untersuchung von Kieselalgen ist ein wesentliches Hilfsmittel in der forensischen Praxis, um festzustellen, ob die Leiche im Wasser ertrunken ist, und um auf den Ertrinkungsort zu schließen. Auch im Bereich Umwelt und Plankton ist die Untersuchung von Kieselalgen ein wichtiger Forschungsinhalt. Die molekularbiologische Testtechnologie für Kieselalgen, die sich auf die Kieselalgen-DNA als primäres Forschungsobjekt konzentriert, ist eine neue Methode der Kieselalgen-Testung. Die DNA-Extraktion von Kieselalgen ist die Grundlage für molekulare Tests von Kieselalgen. Derzeit sind die Kits, die üblicherweise für die DNA-Extraktion von Kieselalgen verwendet werden, teuer, was die Kosten für die Durchführung entsprechender Forschungen erhöht. Unser Labor hat das allgemeine Vollblut-Genom-DNA-Schnellextraktionskit verbessert und einen zufriedenstellenden DNA-Extraktionseffekt für Kieselalgen erzielt, wodurch eine alternative, wirtschaftliche und erschwingliche DNA-Extraktionslösung auf der Basis von Glasperlen für verwandte Forschungen bereitgestellt wird. Die mit diesem Protokoll extrahierte Diatomeen-DNA könnte viele nachgelagerte Anwendungen wie PCR und Sequenzierung erfüllen.
Introduction
In der forensischen Praxis ist die Feststellung, ob eine im Wasser gefundene Leiche ertrunken ist oder nach dem Tod ins Wasser geworfen wurde, für die ordnungsgemäße Lösung des Fallesunerlässlich 1. Es ist auch eines der schwierigen Themen, die in der forensischen Praxis dringend gelöst werden müssen2. Kieselalgen sind in der Natur (insbesondere im Wasser) reichlich vorhanden3,4. Während des Prozesses des Ertrinkens haben die Menschen aufgrund von Hypoxie und Stressreaktion intensive Atembewegungen und atmen eine große Menge Ertrinkungsflüssigkeit ein. Daher gelangen die Kieselalgen im Wasser mit der ertrinkenden Flüssigkeit in die Lunge, und einige Kieselalgen können durch die Alveolar-Kapillar-Barriere in den Blutkreislauf gelangen und sich mit dem Blutfluss auf innere Organe ausbreiten 5,6. Der Nachweis von Kieselalgen in inneren Geweben und Organen wie Lunge, Leber und Knochenmark ist ein starker Beweis für das Ertrinken vor dem Tod 7,8. Derzeit basiert die forensische Untersuchung von Kieselalgen hauptsächlich auf morphologischen Testmethoden. Nach einer Reihe von Vorverdauungen des Gewebes werden die morphologischen, qualitativen und quantitativen Schätzungen der unverdauten Kieselalgen unter dem Mikroskop durchgeführt. Während dieser Zeit müssen gefährliche und umweltschädliche Reagenzien wie Salpetersäure verwendet werden. Dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert von den Forschern ein solides taxonomisches Fachwissen und umfangreiche Erfahrung. All dies stellt das forensische Personal vor gewisse Herausforderungen9. Die Diatomeen-DNA-Testtechnologie ist eine neue Technologie für Diatomeentests, die in den letzten Jahren entwickelt wurde 10,11,12. Diese Technologie realisiert die Speziesidentifikation von Kieselalgen durch Analyse der spezifischen DNA-Sequenzzusammensetzung von Kieselalgen13,14. Die PCR-Technologie und die Sequenzierungstechnologie sind häufig verwendete technische Methoden, deren Grundlage jedoch die erfolgreiche Extraktion von DNA aus Kieselalgen ist. Kieselalgen haben jedoch eine spezielle Struktur, die sich von anderen Organismen unterscheidet, wodurch sich auch ihre DNA-Extraktionstechniken unterscheiden.
Die Zellwand der Kieselalge weist einen hohen Verkieselungsgrad auf, und ihr Hauptbestandteil ist Siliziumdioxid 15,16,17. Die kieselsäurehaltige Zellwand ist sehr hart und muss zerstört werden, bevor die DNA extrahiert werden kann. Gewöhnliche DNA-Extraktionskits sind oft schwierig direkt für die Extraktion von Kieselalgen-DNA zu verwenden, da sie die kieselsäurehaltige Schale von Kieselalgen nicht zerstören können18. Daher ist die Zerstörung der kieselsäurehaltigen Schale von Kieselalgen eines der wichtigsten technischen Probleme, die bei der Extraktion von Kieselalgen-DNA gelöst werden müssen.
Da die Anzahl der Kieselalgen, die in forensischen Forschungsproben enthalten sind, seien es Wasserproben oder Organe und Gewebe von ertrunkenen Körpern, oft begrenzt ist, ist es gleichzeitig notwendig, Kieselalgen anzureichern. Das Wesen der Anreicherung ist die Trennung von Substanzen. Wenn Sie versuchen, Kieselalgen zu sammeln, minimieren Sie den Gehalt an anderen Materialkomponenten (störende Komponenten). Bei forensischen Arbeiten verwenden Laboratorien häufig Zentrifugations- oder Membranfiltrationsanreicherungsmethoden, um Diatomeenzellen zu trennen19. Da Vakuumpumpen jedoch nicht weit verbreitet sind, wird die Methode der Membrananreicherung in gewöhnlichen forensischen Primärlabors nicht häufig eingesetzt. Daher ist die Zentrifugationsmethode immer noch üblicherweise die Anreicherung von Kieselalgen in forensischen Laboratorien20.
Die DNA-Extraktion aus Kieselalgen wird derzeit vor allem in der forensischen Praxis eingesetzt, und es gibt erhebliche Einschränkungen bei ihrer Anwendung. Derzeit gibt es auf dem Markt nur wenige DNA-Extraktionskits für Kieselalgen, die in der Forensik verwendet werden, und sie sind im Allgemeinen teuer21. In diesem Artikel wird eine verbesserte Methode zur Extraktion von Kieselalgen-DNA vorgestellt, die die Extraktion von Kieselalgen-DNA einfach, bequem und kostengünstig macht. Dies erhöht die Anwendung der anschließenden molekularbiologischen Untersuchung von Kieselalgen und kann Probleme im Zusammenhang mit dem Ertrinken in der Gerichtsmedizin durch Kieselalgentests besser lösen. Diese Methode bricht die kieselsäurehaltigen Zellwände von Kieselalgen auf, indem Glasperlen hinzugefügt und eine geeignete Zeit für den Wirbel festgelegt wird. Auf diese Weise lysieren die Proteinase K und die Bindungslösung die Zellen schnell und inaktivieren verschiedene Enzyme in den Zellen. Die genomische DNA wird in der Matrixmembran in der Adsorptionssäule absorbiert und schließlich durch den Elutionspuffer eluiert. Ein solches verbessertes Vollblut-Genextraktionskit verbessert den Diatomeen-DNA-Extraktionseffekt des Blutkits in forensischen Untersuchungsmaterialien, reduziert die Kosten für die Diatomeen-DNA-Extraktion in der forensischen Praxis und kann besser auf die forensische Forschung an der Basis angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kieselalgenzellen sind durch harte kieselsäurehaltige Zellwände17 geschützt, und diese Struktur muss zerstört werden, um Kieselalgen-DNA zu extrahieren. Gewöhnliche Kits zerstören die kieselsäurehaltige Schale von Kieselalgen nicht leicht; Daher ist es schwierig, Diatomeen-DNA erfolgreich zu extrahieren21. Unser Labor hat das am häufigsten verwendete Blut-DNA-Extraktionskit verbessert, indem es Glasperlen mit unterschiedlichen Durchmessern und unterschiedlichen Mass…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) und dem Academician Innovation Platform Scientific Research Project der Provinz Hainan (YSPTZX202134) unterstützt.
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
Referências
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