מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA דיאטומי באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.
Abstract
בדיקת דיאטום היא אמצעי עזר חיוני בפרקטיקה המשפטית כדי לקבוע אם הגופה טבעה במים ולהסיק את מקום הטביעה. בדיקות דיאטום הן גם תוכן מחקרי חשוב בתחום הסביבה והפלנקטון. טכנולוגיית בדיקת הביולוגיה המולקולרית הדיאטומית, המתמקדת בדנ”א דיאטומי כאובייקט המחקר העיקרי, היא שיטה חדשה לבדיקת דיאאטומים. מיצוי DNA דיאטומי הוא הבסיס לבדיקה מולקולרית דיאאטומית. כיום, הערכות הנפוצות למיצוי DNA דיאטום הן יקרות, מה שמגדיל את עלות ביצוע המחקר הנלווה. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת המיצוי המהירה הכללית של DNA גנומי בדם שלם והשיגה אפקט מיצוי DNA דיאטום משביע רצון, ובכך סיפקה פתרון חלופי, חסכוני ובמחיר סביר למיצוי DNA המבוסס על חרוזי זכוכית למחקר קשור. הדנ”א הדיאטום המופק באמצעות פרוטוקול זה יכול לספק יישומים רבים במורד הזרם, כגון PCR וריצוף.
Introduction
בפרקטיקה הפורנזית, הקביעה אם גופה שנמצאה במים טובעת או הושלכה למים לאחר המוות חיונית לפתרון הראוי של המקרה1. זהו גם אחד הנושאים הקשים שיש לפתור בדחיפות בפרקטיקה משפטית2. דיאטומים נמצאים בשפע בסביבה הטבעית (במיוחד במים)3,4. בתהליך של טביעה, עקב היפוקסיה ותגובת מתח, אנשים יהיו תנועות נשימה אינטנסיביות לשאוף כמות גדולה של נוזל טביעה. לכן, הדיאטומים במים נכנסים לריאה עם הנוזל הטובע, וחלק מהדיאטומים יכולים להיכנס למחזור הדם דרך מחסום הנאדיות-נימים ולהתפשט לאיברים פנימיים עם זרימת הדם 5,6. גילוי דיאטומים ברקמות ובאיברים פנימיים כגון ריאות, כבד ומח עצם הוא עדות חזקה לטביעה לפני המוות 7,8. כיום, בדיקות דיאטומיות פורנזיות מבוססות בעיקר על שיטות בדיקה מורפולוגיות. לאחר סדרה של עיכול מראש של הרקמה, הערכות מורפולוגיות איכותיות וכמותיות של דיאטומים לא מעוכלים מתבצעות תחת המיקרוסקופ. במהלך תקופה זו, ריאגנטים מסוכנים ולא ידידותיים לסביבה כגון חומצה חנקתית צריך לשמש. תהליך זה גוזל זמן רב ודורש מהחוקרים מומחיות טקסונומית מוצקה וניסיון רב. כל אלה מביאים אתגרים מסוימים לצוות הזיהוי הפלילי9. טכנולוגיית בדיקת DNA Diatom היא טכנולוגיה חדשה לבדיקות דיאטומיות שפותחה בשנים האחרונות 10,11,12. טכנולוגיה זו מממשת את זיהוי המינים של דיאטומים על ידי ניתוח הרכב רצף הדנ”א הספציפי של דיאטומים13,14. טכנולוגיית PCR וטכנולוגיית ריצוף הן שיטות טכניות נפוצות, אך הבסיס שלהן הוא מיצוי מוצלח של DNA מדיאטומים. עם זאת, לדיאטומים יש מבנה מיוחד שונה מאורגניזמים אחרים, מה שהופך את טכניקות מיצוי הדנ”א שלהם גם שונות.
דופן התא של diatom יש רמה גבוהה של סיליקציה, ואת המרכיב העיקרי שלה הוא דו תחמוצת הסיליקון 15,16,17. דופן התא הסיליקסי קשה מאוד, ויש להרוס אותה לפני מיצוי הדנ”א. ערכות מיצוי דנ”א רגילות הן לעתים קרובות קשות לשימוש ישיר להפקת דנ”א דיאטומי מכיוון שהן אינן יכולות להרוס את הקליפה הסיליקית של דיאטומים18. לכן, השמדת הקליפה הסיליקית של דיאטומים היא אחת הבעיות הטכניות העיקריות שיש לפתור בחילוץ דנ”א דיאטומי.
יחד עם זאת, מכיוון שמספר הדיאטומים הכלולים בדגימות מחקר פורנזי, בין אם דגימות מים או איברים ורקמות של גופות שטבעו, מוגבל לעתים קרובות, יש צורך להעשיר דיאאטומים. מהות ההעשרה היא הפרדת חומרים. בעת ניסיון לאסוף דיאטומים יחד, למזער את התוכן של רכיבי חומר אחרים (רכיבים מפריעים). בעבודה משפטית, מעבדות משתמשות לעתים קרובות בשיטות העשרת צנטריפוגה או סינון ממברנות כדי להפריד תאים דיאטומים19. עם זאת, מכיוון שציוד שאיבת ואקום אינו בשימוש נרחב, שיטת העשרת הממברנה אינה משמשת לעתים קרובות במעבדות משפטיות ראשוניות רגילות. לכן, שיטת הצנטריפוגה היא עדיין העשרת דיאטום נפוצה במעבדות פורנזיות20.
מיצוי DNA מדיאטומים משמש כיום בעיקר בפרקטיקה משפטית, ויש מגבלות משמעותיות ליישומו. כיום, יש מעט ערכות מיצוי DNA דיאטומי המשמשות במדע פורנזי בשוק והן בדרך כלל יקרות21. מאמר זה מספק שיטת מיצוי DNA דיאטומית משופרת, מה שהופך את מיצוי ה- DNA של דיאטום לפשוט, נוח וחסכוני. זה מגביר את היישום של בדיקות ביולוגיה מולקולרית עוקבות של דיאטומים ויכול לפתור טוב יותר בעיות הקשורות לטביעה ברפואה משפטית באמצעות בדיקות דיאאטומים. שיטה זו שוברת את דפנות התאים הסיליקטיים של דיאטומים על ידי הוספת חרוזי זכוכית וקביעת זמן מתאים למערבולת. בדרך זו, פרוטאינאז K ותמיסת הקישור מפעילים במהירות את התאים ומשביתים אנזימים שונים בתאים. הדנ”א הגנומי נספג בקרום המטריקס בעמודת הספיחה ולבסוף נמהל על ידי חיץ האלוציה. ערכת מיצוי גנים משופרת כזו משפרת את אפקט מיצוי ה- DNA הדיאטום של ערכת הדם בחומרי בדיקה משפטית, מפחיתה את עלות מיצוי ה- DNA הדיאטום בפרקטיקה המשפטית, וניתן ליישם אותה טוב יותר במחקר פורנזי עממי.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי דיאטום מוגנים על ידי דפנות תאים סיליקיות קשות17, ויש להרוס מבנה זה כדי לחלץ דנ”א דיאטומי. ערכות רגילות אינן הורסות בקלות את הקליפה הסיליקית של דיאטומים; לכן קשה לחלץ בהצלחה DNA דיאטום21. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת מיצוי הדנ”א בדם הנפוצה ביותר, והוסיפה חרוזי זכוכית ב…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82060341,81560304) ועל ידי פרויקט המחקר המדעי של פלטפורמת החדשנות האקדמית של מחוז האינאן (YSPTZX202134).
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
Referências
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world’s ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
