Extraktion av kiselalgs-DNA från vattenprover och vävnader
Summary
Den här artikeln beskriver ett protokoll för DNA-extraktion av kiselalger med hjälp av ett modifierat vanligt DNA-extraktionskit.
Abstract
Kiselalgstest är ett viktigt hjälpmedel i kriminalteknisk praxis för att avgöra om liket drunknade i vatten och för att dra slutsatser om drunkningsplatsen. Kiselalgstestning är också ett viktigt forskningsinnehåll inom miljö- och planktonområdet. Kiselalgsmolekylärbiologisk testteknik, som fokuserar på kiselalgs-DNA som det primära forskningsobjektet, är en ny metod för kiselalgstestning. Kiselalgers DNA-extraktion är grunden för molekylär testning av kiselalger. För närvarande är de kit som vanligtvis används för kiselalgs-DNA-extraktion dyra, vilket ökar kostnaderna för att utföra relaterad forskning. Vårt laboratorium förbättrade den allmänna snabbextraktionssatsen för helblods-DNA och erhöll en tillfredsställande DNA-extraktionseffekt för kiselalger, vilket ger en alternativ ekonomisk och prisvärd DNA-extraktionslösning baserad på glaspärlor för relaterad forskning. Kiselalgs-DNA som extraheras med hjälp av detta protokoll kan tillfredsställa många nedströmsapplikationer, såsom PCR och sekvensering.
Introduction
I rättsmedicinsk praxis är det viktigt att fastställa om ett lik som hittats i vattnet drunknat eller kastats i vattnet efter döden föratt fallet ska kunna avgöras på ett korrekt sätt. Det är också en av de svåra frågor som måste lösas snarast i forensisk praxis2. Kiselalger är rikligt förekommande i den naturliga miljön (särskilt i vatten)3,4. Under drunkningsprocessen, på grund av hypoxi och stressreaktion, kommer människor att ha intensiva andningsrörelser och andas in en stor mängd drunkningsvätska. Därför kommer kiselalgerna i vattnet in i lungan med drunkningsvätskan, och vissa kiselalger kan komma in i blodcirkulationen genom den alveolära kapillärbarriären och sprida sig till inre organ med blodflödet 5,6. Detektion av kiselalger i inre vävnader och organ som lungor, lever och benmärg är ett starkt bevis på drunkning före döden 7,8. För närvarande är forensisk kiselalgstestning huvudsakligen baserad på morfologiska testmetoder. Efter en serie fördigestioner av vävnaden utförs de morfologiska kvalitativa och kvantitativa uppskattningarna av osmälta kiselalger under mikroskopet. Under denna period måste farliga och miljöovänliga reagenser som salpetersyra användas. Denna process är tidskrävande och kräver att forskarna har gedigen taxonomisk expertis och lång erfarenhet. Allt detta medför vissa utmaningar för den kriminaltekniska personalen9. Diatom DNA-testteknik är en ny teknik för kiselalgstestning som utvecklats under de senaste åren 10,11,12. Denna teknik realiserar artidentifieringen av kiselalger genom att analysera den specifika DNA-sekvenssammansättningen av kiselalger13,14. PCR-teknik och sekvenseringsteknik är vanligt förekommande tekniska metoder, men deras grund är framgångsrik extraktion av DNA från kiselalger. Kiselalger har dock en speciell struktur som skiljer sig från andra organismer, vilket gör att deras DNA-extraktionstekniker också skiljer sig åt.
Kiselalgens cellvägg har en hög grad av kiselifiering, och dess huvudkomponent är kiseldioxid 15,16,17. Den kiselhaltiga cellväggen är mycket hård och måste förstöras innan DNA:t extraheras. Vanliga DNA-extraktionssatser är ofta svåra att använda direkt för extraktion av kiselalgs-DNA eftersom de inte kan förstöra kiseldioxidskalet18. Att förstöra kiselalgernas kiselhaltiga skal är därför ett av de viktigaste tekniska problemen som måste lösas vid utvinning av kiselalgs-DNA.
Samtidigt, eftersom antalet kiselalger som finns i rättsmedicinska forskningsprover, oavsett om det är vattenprover eller organ och vävnader från drunknade kroppar, ofta är begränsat, är det nödvändigt att anrika kiselalger. Kärnan i berikning är separationen av ämnen. När du försöker samla ihop kiselalger, minimera innehållet av andra materialkomponenter (störande komponenter). I kriminaltekniskt arbete använder laboratorier ofta centrifugerings- eller membranfiltreringsanrikningsmetoder för att separera kiselalgsceller19. Men eftersom vakuumpumputrustning inte används i stor utsträckning används membrananrikningsmetoden inte ofta i vanliga primära kriminaltekniska laboratorier. Så centrifugeringsmetoden är fortfarande vanligt kiselalgsanrikning i kriminaltekniska laboratorier20.
DNA-extraktion från kiselalger används för närvarande främst i kriminalteknisk praxis, och det finns betydande begränsningar för dess tillämpning. För närvarande finns det få kiselalgs-DNA-extraktionssatser som används inom kriminalteknik på marknaden och de är i allmänhet dyra21. Den här artikeln ger en förbättrad DNA-extraktionsmetod för kiselalger, vilket gör DNA-extraktion av kiselalger enkel, bekväm och kostnadseffektiv. Detta ökar tillämpningen av efterföljande molekylärbiologisk testning av kiselalger och kan bättre lösa problem relaterade till drunkning inom rättsmedicin genom kiselalgstestning. Denna metod bryter kiseldioxidcellväggarna hos kiselalger genom att tillsätta glaspärlor och ställa in en lämplig tid för virveln. På så sätt lyserar proteinas K och bindningslösningen snabbt cellerna och inaktiverar olika enzymer i cellerna. Det genomiska DNA:t absorberas i matrismembranet i adsorptionskolonnen och elueras slutligen av elueringsbufferten. Ett sådant förbättrat kit för extraktion av helblodsgener förbättrar kiselalgens DNA-extraktionseffekt av blodsatsen i rättsmedicinska undersökningsmaterial, minskar kostnaden för kiselalgs-DNA-extraktion i kriminalteknisk praxis och kan bättre tillämpas på kriminalteknisk forskning på gräsrotsnivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kiselalgsceller skyddas av hårda kiselhaltiga cellväggar17, och denna struktur måste förstöras för att extrahera kiselalgs-DNA. Vanliga kit förstör inte lätt kiseldioxidskalet; därför är det svårt att framgångsrikt extrahera kiselalgs-DNA21. Vårt laboratorium förbättrade det vanligaste blod-DNA-extraktionskitet genom att lägga till glaspärlor med olika diametrar och olika massförhållanden i processen för kiselalgsextraktion. Vortex-oscillation utförs …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) och av Academician Innovation Platform Scientific Research Project of Hainan Province (YSPTZX202134).
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
Referências
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world’s ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
