Su Örneklerinden ve Dokulardan Diatom DNA'nın Ekstraksiyonu
Summary
Bu makale, modifiye edilmiş bir ortak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak diatom DNA ekstraksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır.
Abstract
Diatom testi, adli tıp pratiğinde cesedin suda boğulup boğulmadığını belirlemek ve boğulma yerini belirlemek için önemli bir yardımcı araçtır. Diatom testi aynı zamanda çevre ve plankton alanında da önemli bir araştırma içeriğidir. Birincil araştırma nesnesi olarak diatom DNA’ya odaklanan diatom moleküler biyoloji test teknolojisi, yeni bir diatom testi yöntemidir. Diatom DNA ekstraksiyonu, diatom moleküler testinin temelidir. Şu anda, diatom DNA ekstraksiyonu için yaygın olarak kullanılan kitler pahalıdır ve bu da ilgili araştırmaları yürütme maliyetini artırmaktadır. Laboratuvarımız genel tam kan genomik DNA hızlı ekstraksiyon kitini geliştirdi ve tatmin edici bir diatom DNA ekstraksiyon etkisi elde etti, böylece ilgili araştırmalar için cam boncuklara dayalı alternatif, ekonomik ve uygun fiyatlı bir DNA ekstraksiyon çözümü sağladı. Bu protokol kullanılarak ekstrakte edilen diatom DNA, PCR ve dizileme gibi birçok aşağı akış uygulamasını karşılayabilir.
Introduction
Adli tıp uygulamasında, suda bulunan bir cesedin boğularak mı yoksa öldükten sonra mı suya atıldığının belirlenmesi, davanın doğru çözümlenmesi için esastır1. Aynı zamanda adli tıp uygulamasında acilen çözülmesi gereken zor konulardan biridir2. Diatomlar doğal ortamda (özellikle suda) bol miktarda bulunur3,4. Boğulma sürecinde, hipoksi ve stres tepkisi nedeniyle, insanlar yoğun solunum hareketlerine sahip olacak ve çok miktarda boğulma sıvısını soluyacaklardır. Bu nedenle sudaki diatomlar boğulma sıvısı ile akciğere girer ve bazı diatomlar alveolar-kılcal damar bariyeri yoluyla kan dolaşımına girebilir ve kan akımı ile iç organlara yayılabilir 5,6. Akciğer, karaciğer ve kemik iliği gibi iç doku ve organlarda diatomların saptanması, ölümden önce boğulmanın güçlü bir kanıtıdır 7,8. Şu anda, adli diatom testi esas olarak morfolojik test yöntemlerine dayanmaktadır. Dokunun bir dizi ön sindiriminden sonra, sindirilmemiş diatomların morfolojik kalitatif ve kantitatif tahminleri mikroskop altında gerçekleştirilir. Bu süre zarfında, nitrik asit gibi tehlikeli ve çevre dostu olmayan reaktiflerin kullanılması gerekir. Bu süreç zaman alıcıdır ve araştırmacıların sağlam taksonomik uzmanlığa ve kapsamlı deneyime sahip olmasını gerektirir. Bunların hepsi adli tıp personeline bazı zorluklar getiriyor9. Diatom DNA test teknolojisi, son yıllarda geliştirilen diatom testi için yeni bir teknolojidir 10,11,12. Bu teknoloji, diatomların13,14 spesifik DNA dizisi bileşimini analiz ederek diatomların tür tanımlamasını gerçekleştirir. PCR teknolojisi ve dizileme teknolojisi yaygın olarak kullanılan teknik yöntemlerdir, ancak temelleri DNA’nın diatomlardan başarılı bir şekilde çıkarılmasıdır. Bununla birlikte, diatomların diğer organizmalardan farklı özel bir yapısı vardır, bu da DNA ekstraksiyon tekniklerini de farklı kılar.
Diatomun hücre duvarı yüksek derecede silisleşmeye sahiptir ve ana bileşeni silikon dioksit 15,16,17’dir. Silisli hücre duvarı çok serttir ve DNA’yı çıkarmadan önce yok edilmesi gerekir. Sıradan DNA ekstraksiyon kitlerinin, diatomların18 silisli kabuğunu yok edemedikleri için doğrudan diatom DNA’nın ekstraksiyonu için kullanılması genellikle zordur. Bu nedenle, diatomların silisli kabuğunun yok edilmesi, diatom DNA’sının çıkarılmasında çözülmesi gereken en önemli teknik sorunlardan biridir.
Aynı zamanda, adli araştırma örneklerinde bulunan diatomların sayısı, ister su örnekleri ister boğulmuş cesetlerin organ ve dokuları olsun, genellikle sınırlı olduğundan, diatomları zenginleştirmek gerekir. Zenginleştirmenin özü, maddelerin ayrılmasıdır. Diatomları bir araya getirmeye çalışırken, diğer malzeme bileşenlerinin (enterferans yapan bileşenler) içeriğini en aza indirin. Adli çalışmalarda, laboratuvarlar genellikle diatom hücrelerini ayırmak için santrifüjleme veya membran filtrasyon zenginleştirme yöntemlerini kullanır19. Bununla birlikte, vakum pompalama ekipmanı yaygın olarak kullanılmadığından, membran zenginleştirme yöntemi sıradan birincil adli tıp laboratuvarlarında sıklıkla kullanılmamaktadır. Bu nedenle, santrifüjleme yöntemi hala adli laboratuvarlarda yaygın olarak diatom zenginleştirmedir20.
Diatomlardan DNA ekstraksiyonu şu anda öncelikle adli tıp pratiğinde kullanılmaktadır ve uygulamasında önemli sınırlamalar vardır. Şu anda, piyasada adli bilimlerde kullanılan az sayıda diatom DNA ekstraksiyon kiti bulunmaktadır ve bunlar genellikle pahalıdır21. Bu makale, diatom DNA ekstraksiyonunu basit, kullanışlı ve uygun maliyetli hale getiren gelişmiş bir diatom DNA ekstraksiyon yöntemi sağlar. Bu, diatomların sonraki moleküler biyoloji testlerinin uygulanmasını artırır ve diatom testi yoluyla adli tıpta boğulma ile ilgili sorunları daha iyi çözebilir. Bu yöntem, cam boncuklar ekleyerek ve girdap için uygun bir zaman ayarlayarak diatomların silisli hücre duvarlarını kırar. Bu şekilde proteinaz K ve bağlayıcı çözelti hücreleri hızla parçalar ve hücrelerdeki çeşitli enzimleri etkisiz hale getirir. Genomik DNA, adsorpsiyon kolonundaki matris zarında emilir ve son olarak elüsyon tamponu tarafından ayrıştırılır. Böyle geliştirilmiş bir tam kan geni ekstraksiyon kiti, adli muayene materyallerinde kan kitinin diatom DNA ekstraksiyon etkisini iyileştirir, adli tıp uygulamasında diatom DNA ekstraksiyonunun maliyetini düşürür ve adli araştırmalara daha iyi uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diatom hücreleri, sert silisli hücre duvarları17 tarafından korunur ve diatom DNA’sını çıkarmak için bu yapının yok edilmesi gerekir. Sıradan kitler, diatomların silisli kabuğunu kolayca tahrip etmez; bu nedenle diatom DNA21’i başarılı bir şekilde çıkarmak zordur. Laboratuvarımız, diatom ekstraksiyonu işleminde farklı çaplarda ve farklı kütle oranlarında cam boncuklar ekleyerek en sık kullanılan kan DNA ekstraksiyon kitini geliştirdi. Vorteks …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82060341,81560304) ve Hainan Eyaleti Akademisyen İnovasyon Platformu Bilimsel Araştırma Projesi (YSPTZX202134) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
Referências
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world’s ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
