Extracción de ADN de diatomeas a partir de muestras de agua y tejidos
Summary
Este artículo describe un protocolo para la extracción de ADN de diatomeas utilizando un kit de extracción de ADN común modificado.
Abstract
La prueba de diatomeas es un medio auxiliar esencial en la práctica forense para determinar si el cadáver se ahogó en el agua e inferir el lugar del ahogamiento. Las pruebas de diatomeas también son un importante contenido de investigación en el campo del medio ambiente y el plancton. La tecnología de pruebas de biología molecular de diatomeas, que se centra en el ADN de diatomeas como objeto de investigación principal, es un nuevo método de prueba de diatomeas. La extracción de ADN de diatomeas es la base de las pruebas moleculares de diatomeas. En la actualidad, los kits comúnmente utilizados para la extracción de ADN de diatomeas son costosos, lo que aumenta el costo de llevar a cabo investigaciones relacionadas. Nuestro laboratorio mejoró el kit general de extracción rápida de ADN genómico de sangre entera y obtuvo un efecto satisfactorio de extracción de ADN de diatomeas, proporcionando así una solución alternativa de extracción de ADN económica y asequible basada en perlas de vidrio para la investigación relacionada. El ADN de diatomeas extraído mediante este protocolo podría satisfacer muchas aplicaciones posteriores, como la PCR y la secuenciación.
Introduction
En la práctica forense, determinar si un cadáver encontrado en el agua ahogándose o fue arrojado al agua después de la muerte es esencial para la correcta resolución del caso1. También es una de las cuestiones difíciles que deben resolverse con urgencia en la práctica forense2. Las diatomeas son abundantes en el medio natural (especialmente en el agua)3,4. En el proceso de ahogamiento, debido a la hipoxia y la respuesta al estrés, las personas tendrán movimientos respiratorios intensos e inhalarán una gran cantidad de líquido de ahogamiento. Por lo tanto, las diatomeas en el agua ingresan al pulmón con el líquido que se ahoga, y algunas diatomeas pueden ingresar a la circulación sanguínea a través de la barrera alveolar-capilar y extenderse a los órganos internos con el flujo sanguíneo 5,6. La detección de diatomeas en tejidos y órganos internos como pulmón, hígado y médula ósea es una fuerte evidencia de ahogamiento antes de la muerte 7,8. En la actualidad, las pruebas forenses de diatomeas se basan principalmente en métodos de pruebas morfológicas. Después de una serie de predigestión del tejido, las estimaciones morfológicas cualitativas y cuantitativas de las diatomeas no digeridas se llevan a cabo bajo el microscopio. Durante este período, es necesario utilizar reactivos peligrosos y poco respetuosos con el medio ambiente, como el ácido nítrico. Este proceso requiere mucho tiempo y requiere que los investigadores tengan sólidos conocimientos taxonómicos y una amplia experiencia. Todo esto conlleva ciertos desafíos para el personal forense9. La tecnología de prueba de ADN de diatomeas es una nueva tecnología para la prueba de diatomeas desarrollada en los últimos años 10,11,12. Esta tecnología realiza la identificación de especies de diatomeas mediante el análisis de la composición específica de la secuencia de ADN de las diatomeas13,14. La tecnología de PCR y la tecnología de secuenciación son métodos técnicos comúnmente utilizados, pero su base es la extracción exitosa de ADN de diatomeas. Sin embargo, las diatomeas tienen una estructura especial diferente a la de otros organismos, lo que hace que sus técnicas de extracción de ADN también sean diferentes.
La pared celular de la diatomea tiene un alto grado de silicificación, y su componente principal es el dióxido de silicio 15,16,17. La pared celular silícea es muy dura y debe ser destruida antes de extraer el ADN. Los kits de extracción de ADN ordinarios suelen ser difíciles de utilizar directamente para la extracción de ADN de diatomeas porque no pueden destruir la capa silícea de diatomeas18. Por lo tanto, la destrucción de la capa silícea de las diatomeas es uno de los problemas técnicos clave a resolver en la extracción del ADN de diatomeas.
Al mismo tiempo, dado que el número de diatomeas contenidas en las muestras de investigación forense, ya sean muestras de agua u órganos y tejidos de cuerpos ahogados, suele ser limitado, es necesario enriquecer las diatomeas. La esencia del enriquecimiento es la separación de sustancias. Al tratar de juntar diatomeas, minimice el contenido de otros componentes materiales (componentes que interfieren). En el trabajo forense, los laboratorios a menudo utilizan métodos de enriquecimiento por centrifugación o filtración por membrana para separar las células de diatomeas19. Sin embargo, dado que el equipo de bombeo de vacío no se usa ampliamente, el método de enriquecimiento por membrana no se usa a menudo en los laboratorios forenses primarios ordinarios. Por lo tanto, el método de centrifugación sigue siendo comúnmente el enriquecimiento de diatomeas en los laboratorios forenses20.
La extracción de ADN a partir de diatomeas se utiliza actualmente principalmente en la práctica forense, y existen importantes limitaciones para su aplicación. En la actualidad, existen pocos kits de extracción de ADN de diatomeas utilizados en la ciencia forense en el mercado y generalmente son caros21. Este artículo proporciona un método mejorado de extracción de ADN de diatomeas, lo que hace que la extracción de ADN de diatomeas sea simple, conveniente y rentable. Esto aumenta la aplicación de las pruebas posteriores de biología molecular de las diatomeas y puede resolver mejor los problemas relacionados con el ahogamiento en la medicina forense a través de las pruebas de diatomeas. Este método rompe las paredes celulares silíceas de las diatomeas mediante la adición de perlas de vidrio y el establecimiento de un tiempo apropiado para el vórtice. De esta manera, la proteinasa K y la solución de unión lisan rápidamente las células e inactivan varias enzimas en las células. El ADN genómico se absorbe en la membrana de la matriz en la columna de adsorción y finalmente es eluido por el tampón de elución. Un kit de extracción de genes de sangre total mejorado mejora el efecto de extracción de ADN de diatomeas del kit de sangre en materiales de examen forense, reduce el costo de la extracción de ADN de diatomeas en la práctica forense y se puede aplicar mejor a la investigación forense de base.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células de diatomeas están protegidas por paredes celulares silíceas duras17, y esta estructura debe ser destruida para extraer el ADN de diatomeas. Los kits ordinarios no destruyen fácilmente la cáscara silícea de las diatomeas; por lo tanto, es difícil extraer con éxito el ADN de diatomeas21. Nuestro laboratorio mejoró el kit de extracción de ADN sanguíneo más utilizado, añadiendo perlas de vidrio de diferentes diámetros y diferentes proporciones de masa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82060341,81560304) y del Proyecto de Investigación Científica de la Plataforma de Innovación Académica de la Provincia de Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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